山羊TNNT3基因可變剪切及其對骨骼肌細胞分化的作用

陳媛，蔡禾，李利，王林杰，仲濤，張紅平

山羊TNNT3基因可變剪切及其對骨骼肌細胞分化的作用

陳媛，蔡禾，李利，王林杰，仲濤，張紅平*

四川農(nóng)業(yè)大學畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室，成都 611130

【目的】快速骨骼肌肌鈣蛋白T（fast skeletal troponin T3，TNNT3）作為肌鈣蛋白(troponin, Tn)家族成員，調(diào)節(jié)橫紋肌收縮、參與骨骼肌的生長發(fā)育并影響家畜肉質(zhì)性狀。通過獲得山羊TNNT3基因的可變剪切體，分析山羊TNNT3基因可變剪切的表達模式及其在肌細胞分化中的作用，深入解析TNNT3基因在山羊骨骼肌生長發(fā)育過程中的作用機制。【方法】基于NCBI已公布山羊TNNT3基因（NM_001314210.1）和牛TNNT3基因（XM_010821200）mRNA序列，使用軟件Primer Premier 6.0設計引物，以簡州大耳羊胚胎期和出生后7個階段骨骼肌為試驗材料，克隆測序獲得山羊TNNT3基因的CDS區(qū)可變剪切體，利用軟件ORF Finder、EditSeq、DNAMAN、ClustalW和MEGA_X_10.1.8等對序列進行生物信息學分析；進一步設計實時熒光定量（real-time PCR，RT-qPCR）及半定量引物，研究TNNT3基因剪切體在7個不同組織（背最長肌（longissimus dorsi muscle，LD）、半膜肌（semimembranosus muscle，SM）、心、肝、脾、肺、腎）和7個發(fā)育階段（胚胎期E75、E90、E105和出生后B3、B45、B150、B300）肌肉組織（背最長肌和半膜肌）中表達模式；此外，對轉(zhuǎn)錄本進行體外編碼能力檢測確定其具有編碼蛋白的能力，并在山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞（skeletal muscle satellite cells，MuSCs）中過表達，觀察細胞形態(tài)變化以及檢測標志基因的表達變化，研究其對山羊MuSCs分化的作用。【結果】①（NM_001314210.1）CDS區(qū)全序列主要含有18個外顯子，其中外顯子16/17相互排斥，轉(zhuǎn)錄后單一表達。克隆發(fā)現(xiàn)山羊TNNT3基因 5個新轉(zhuǎn)錄本（—），其外顯子數(shù)分別是15、15、20、16、14。②生物信息學分析結果顯示山羊TNNT3基因核苷酸序列和氨基酸序列與綿羊、牛、豬等哺乳動物具有很高的一致性，而與魚類和爬行類動物的一致性較低，說明TNNT3基因序列在哺乳動物高度保守。③mRNA在背最長肌、半膜肌、心、肝、脾、肺、腎7個組織中都有表達，其中在骨骼肌中高度富集(< 0.01)，心臟及肺次之，其余組織中較低；mRNA在背最長肌和半膜肌中的表達始終處于一個動態(tài)變化中，胚胎期在半膜肌的表達量高于背最長肌（<0.05）；出生后則背最長肌中高于半膜肌（<0.05）。④山羊TNNT3基因轉(zhuǎn)錄本重復出現(xiàn)保守的外顯子9—11（138bp），體外翻譯實驗顯示其可編碼蛋白且蛋白大小與預期基本相符（37 kD）；相較于對照組，在山羊MuSCs中過表達該轉(zhuǎn)錄本使肌分化標志基因、和mRNA極顯著升高(< 0.01)。【結論】獲得了山羊TNNT3基因具有完整CDS區(qū)5個新可變剪切體，主要在肌肉組織（背最長肌和半膜肌）中高表達，在哺乳動物中高度保守且促進成肌分化。初步表明TNNT3基因在動物肌肉生長發(fā)育中具有重要的生物學功能。

山羊；；可變剪切體；熒光定量PCR；體外轉(zhuǎn)錄翻譯；蛋白免疫印跡雜交；肌原分化

0 引言

【研究意義】解析動物產(chǎn)肉性狀形成的內(nèi)在分子機制一直是肉用家畜領域研究的核心問題。肌鈣蛋白（troponin, Tn）屬于鈣離子結合蛋白多基因家族的成員。肌鈣蛋白復合物作為對鈣敏感的分子開關，位于橫紋肌的細絲上，能調(diào)節(jié)橫紋肌收縮以響應細胞內(nèi)鈣濃度的變化[1]并影響家畜肉質(zhì)性狀[2-3]。簡州大耳羊是我國培育的第二個肉用山羊新品種，具有體型大、生長速度快、耐粗飼、繁殖能力高、抗病能力強等特點。為了探究肌鈣蛋白在山羊肌肉生長發(fā)育中的作用，為此研究了快速骨骼肌肌鈣蛋白T（fast skeletal troponin T3，TNNT3）在簡州大耳羊不同組織和不同發(fā)育階段中的可變剪切及表達模式。【前人研究進展】Tn由Ebashi于1963年首先發(fā)現(xiàn)[4]，它是由3個亞基組成的復合物：分別是與鈣結合的肌鈣蛋白C（TNNC）；原肌球蛋白Tm結合亞基肌鈣蛋白T（TNNT）；抑制肌肉收縮的肌鈣蛋白I（TNNI）[5]。TNNT是肌鈣蛋白復合物與Tm 之間的連接結構，是對Ca2+敏感及Ca2+介導的肌動球蛋白ATP酶活性活化所必要的成分[6]，在向肌節(jié)發(fā)送Ca2+信號中起著關鍵作用。哺乳動物的TNNT是一種在動物體肌肉和器官組織熟化過程中容易降解的原纖維蛋白[7]。其分子量在31—32 kD之間，約含有223—305個氨基酸，由一個球形C端和一個桿狀N端組成，呈不對稱結構（圖1-B）。TNNT具有3個亞型并在脊椎動物中呈現(xiàn)組織特異性：慢骨骼肌肌鈣蛋白、心肌肌鈣蛋白和快速骨骼肌肌鈣蛋白，這3種亞型分別由基因、和編碼[8]。與、最大的區(qū)別是可以發(fā)生復雜的可變剪切（圖1-A）。在高脂飲食誘導的選擇性剪切中對飽和脂肪酸起到了修飾作用，如大鼠骨骼肌通過pre-mRNA選擇性剪接修飾基因表達而對飲食中脂肪過量消耗作出反應。有趣的是，這種效應只存在于富含豬油的飲食中，因為富含單不飽和脂肪酸或多不飽和脂肪酸的飲食對替代剪接沒有影響[9]。然而，飽和脂肪酸是否直接作用于肌肉細胞以調(diào)節(jié)替代的pre-mRNA剪接未被評估，飽和脂肪酸促進選擇性剪切改變的信號通路也尚不清楚。此外，還參與骨骼肌的生長發(fā)育，是平滑肌生長和胎兒出生后生存所必需的[10]。例如在小鼠成肌細胞C2C12肌管分化過程中，mRNA、蛋白的表達顯著升高，剪接形式也由D0時的3種低豐度表達增加到D8時肌管中有15種未在成肌細胞中檢測到的剪接形式[11]。【本研究切入點】選擇性剪接是一種在轉(zhuǎn)錄后RNA水平上調(diào)控基因表達的重要機制，它涉及順式和反式作用因子的動態(tài)相互作用以協(xié)調(diào)剪接體在前體mRNA (pre-mRNA)上的位置[12-14]。選擇性剪接是pre-mRNA轉(zhuǎn)化為成熟mRNA過程中的一個關鍵步驟，通過不同的剪切方式從一個基因中產(chǎn)生多個成熟的mRNA和結構功能差異的翻譯產(chǎn)物[15]，可以顯著擴大轉(zhuǎn)錄組，同時增加蛋白質(zhì)組的可塑性和功能性[16-17]。TNNT3基因已經(jīng)在人、豬、斑馬魚、原雞、牛和老鼠有一定研究[18-19]，在牛的肌肉組織中也發(fā)現(xiàn)了不同類型的剪切體，但目前關于山羊可變剪切體的序列分析、表達規(guī)律以及具體功能尚未有報道。【擬解決的關鍵問題】本研究以簡州大耳羊骨骼肌為研究材料，克隆山羊TNNT3基因可變剪切體的CDS序列，檢測其在出生后3 d簡州大耳羊（母羊3只）不同組織（心臟、肝臟、脾、肺、腎臟、背最長肌和半膜肌）以及不同發(fā)育階段（胚胎期75、90、105 d以及出生后3、45、150和300 d）山羊肌肉組織中mRNA水平的表達差異，初探TNNT3基因在山羊肌肉生長發(fā)育過程中的表達模式，為揭示山羊TNNT3基因可變剪切體在哺乳動物中的作用及進一步拓展肉羊肌肉生長發(fā)育的分子調(diào)控機制提供科學依據(jù)。

A：3種TnT亞型可變剪切外顯子結構示圖: 紅色表示可變剪切外顯子；藍色表示胚胎特異性外顯子；綠色為鳥類特有的外顯子；B：肌鈣蛋白T的互作蛋白

1 材料與方法

本試驗于2019年在四川農(nóng)業(yè)大學畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室完成，試驗涉及的所有過程均嚴格遵循動物福利進行。

1.1 樣品采集

大多數(shù)動物肌纖維發(fā)育在胚胎中后期，并在出生前就己確定肌纖維數(shù)目，出生后不再增加。動物出生后早期，肌纖維會隨著骨骼肌對代謝與功能需求的改變而發(fā)生轉(zhuǎn)變，運動、激素、神經(jīng)刺激、不同生理狀態(tài)等均可引起不同程度的骨骼肌肌纖維類型的轉(zhuǎn)變[23]。所以本次試驗動物樣品選擇了胚胎期75、90和105 d（E75、E90、E105）以及出生后3、45、150和300 d（B3、B45、B150、B300）共7個時間點的簡州大耳羊（每個時期3只母羔）的背最長肌、半膜肌以及心、肝、脾、肺、腎組織樣品，胚胎期羔羊通過剖腹產(chǎn)手術從妊娠母羊子宮中取出。整個采樣操作在無菌條件下進行，半小時內(nèi)采集清洗樣品后，立刻凍入液氮中低溫運回實驗室后，置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 RNA的抽提、檢測與反轉(zhuǎn)錄

將樣品在液氮不完全揮發(fā)條件下研磨成粉末狀，取100 mg組織樣采用Trizol（Invitrogen USA）法提取樣品總RNA。利用凝膠成像分析儀（Bio-Bad）以及核酸蛋白儀測定RNA 18S與28S條帶亮度和RNA在260nm和280nm下吸光度值及比值，初步判定質(zhì)量并記錄總RNA濃度與純度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScrip RT reagent Kit，TaKaRa，Japan）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 山羊TNNT3基因的克隆

在NCBI數(shù)據(jù)庫中選擇山羊TNNT3（NM_ 001314210.1）基因和牛TNNT3（XM_010821200）基因保守區(qū)域，用Primer Premier 6.0設計山羊TNNT3基因CDS區(qū)分子克隆引物P1（表1）。以山羊不同時期肌肉組織cDNA混合樣為模板，PCR擴增山羊TNNT3基因CDS區(qū)序列。PCR反應體系為50μL，包括2×Master Mix Taq酶20 μL，P1上、下游引物（10 μmol·L-1）各2 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 24.5 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃30 s, 58 ℃ 30 s, 72℃ 50 s, 36個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，最后12 ℃保存。反應產(chǎn)物于1.5 %瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像分析儀成像分析電泳條帶，瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒（Omega，USA）進行產(chǎn)物回收。根據(jù)TaKaRa pMD?19-T Vector（Japan）使用說明，向1.5 mL離心管中依次加入pMD?19-T Vector 0.5 μL，PCR回收產(chǎn)物3.0 μL，分子生物學用水1.5 μL，Solution I 5.0 μL，連接后的載體轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，將初步鑒定出的陽性單克隆菌液利用DL2000 DNA marker比對篩選出和目的條帶有差異的條帶，取500 μL菌液樣品送至成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序。

1.4 TNNT3生物信息學分析

將測序所得序列利用BLAST在線進行序列比對確認基因克隆準確性，使用ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對序列進行開放閱讀框的預測，并翻譯為氨基酸序列；EditSeq 7.10軟件以及ProtParam用于預測不同轉(zhuǎn)錄本所翻譯蛋白的氨基酸組成、分子質(zhì)量、等電點以及不同轉(zhuǎn)錄本的二級和三級結構；通過ClustalW整合選出有差異的序列，用MEGA_X_10.1.8軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.5 實時熒光定量及半定量

根據(jù)克隆出的山羊新轉(zhuǎn)錄本序列，選用（NM_001009784）作為內(nèi)參基因，采用Primer Premier 6.0在保守區(qū)域設計定量引物P2和P6（表1）。所用real-time PCR系統(tǒng)為Bio-Rad CFX96實時熒光定量PCR儀。擴增體系10 μL包括TB Green 5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，cDNA 0.8 μL，滅菌蒸餾水3.4 μL。反應條件：95℃預變性30 s；95℃ 5 s；引物特異退火溫度Tm 30 s，39個循環(huán)；以0.5℃/s的速度從65 ℃緩慢遞增到95℃。設立3個生物學重復，每個樣品3次技術重復。在各轉(zhuǎn)錄本差異序列的兩端設計半定量引物P3（表1），對各轉(zhuǎn)錄本進行半定量檢測PCR反應條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，Tm℃ 30 s，72℃ 50 s，26個循環(huán)；72℃延伸5 min，最后12℃保存。

表1 TNNT3基因引物序列信息

下劃線部分為酶切位點（加粗）和保護堿基 The underlined parts are the restriction sites (bold) and the protective bases

1.6 TNT體外轉(zhuǎn)錄翻譯

綜合考慮轉(zhuǎn)錄本CDS區(qū)自帶的酶切位點以及pCMV-Flag載體所自帶的酶切位點，選定限制性內(nèi)切酶d III和I。結合酶切保護堿基以及CDS區(qū)序列信息設計TNT引物P4（表1）。利用設計引物進行PCR擴增，切膠回收產(chǎn)物送樣測序正確后與pCMV-Flag載體同時進行雙酶切。酶切反應體系：2×buffer 5 μL，膠回收產(chǎn)物/空載5 μL，限制性內(nèi)切酶d III和I各1 μL，ddH2O 38 μL。利用T4 DNA連接酶構建載體，反應體系為10 μL（目的片段的酶切膠回收產(chǎn)物7.2 μL，酶切后的空載回收產(chǎn)物0.8 μL，T4及T4 buffer各1 μL）。克隆獲得的菌液利用E.Z.N.A.Endo-free Plasmid Mini kit II Spin Protocol 質(zhì)粒提取試劑盒完成質(zhì)粒提取。體外轉(zhuǎn)錄翻譯使用試劑盒進行。

1.7 Western Blot

翻譯蛋白的定量參照BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0010S）檢測濃度后計算含10—50 μg蛋白的溶液體積上樣。SDS-PAGE 電泳是采用10 %分離膠和4 %濃縮膠，95 °C變性5 min。電泳時設置電壓40 V，電泳25 min，后用100 V，電泳80 min。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說明進行（組裝濾紙凝膠纖維素夾層，恒壓選25 V，電泳30 min）；轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜正面朝上完全浸入封閉液中，依據(jù)封閉液說明書，37 °C放置1.5—2 h。一抗4°C孵育過夜；用TBST漂洗4次，每次10 min，二抗37 °C孵育1.5—2 h，再用TBST漂洗3—5次，每次10 min。按照顯色試劑盒進行操作顯色后用成像儀照相得到蛋白圖片。

1.8 TNNT3_3過表達檢測

利用過表達引物P5（表1）構建過表達質(zhì)粒（載體構建及質(zhì)粒提取操作與TNT體外轉(zhuǎn)錄翻譯相同）。將MuSCs（畜禽遺傳資源挖掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室分離凍存）以2.5×104個/孔的密度鋪至6孔板中，匯合度為80 %進行瞬時轉(zhuǎn)染，每孔用250 μL Opti-DMEM （無血清）分別室溫孵育3 μg質(zhì)粒DNA和2 μL lip2000 5 min，后混合孵育20 min；將孵育好的轉(zhuǎn)染液逐滴加入到已更換為無血清培養(yǎng)基的細胞中，輕輕晃動6孔板；轉(zhuǎn)染4—6 h后更換為10 % FBS的生長培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染24 h改成分化培養(yǎng)基，通過顯微鏡觀察綠色熒光蛋白判斷轉(zhuǎn)染效率；轉(zhuǎn)染48 h收取對照組和處理組細胞進行RNA抽提。對標志基因進行RT-qPCR定量檢測。

1.9 免疫熒光

將山羊MuSCs以2.5×104個/孔的密度鋪至35 mm單孔板，匯合度為80%進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后誘導分化。分化7d后用PBS輕輕晃動清洗3次，每次5 min；加入4%多聚甲醛，室溫固定15 min；PBS晃動清洗3次，每次5 min，加入0.5 %曲拉通trion-X-100 4℃處理10 min；PBS晃動清洗3次，每次5 min，用2% BSA 37℃封閉2 h；棄去封閉液，加入稀釋好的一抗，4℃孵育過夜；PBS晃動清洗3次，每次5 min，避光加入稀釋好的二抗，37 ℃孵育2 h；避光條件下PBS晃動清洗3次，每次5 min，加入0.05%的DAPI染液，37℃避光孵育10 min；避光條件下PBS晃動清洗3次，每次5 min，在倒置熒光顯微鏡下成像拍照。

1.10 數(shù)據(jù)分析

對擴增效率達到95%—105%的產(chǎn)物，根據(jù)Bio-Rad CFX96自帶分析軟件計算各基因各時間點的拷貝數(shù)，以作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法[24]進行目的基因相對表達量的計算。運用軟件SAS 9.1的PROC GLM程序進行最小二乘分析，結果以最小二乘均數(shù)±標準誤表示，并利用Duncan法進行均數(shù)間的多重比較。

2 結果

2.1 山羊TNNT3基因的克隆及序列分析

測序結果表明，利用引物P1以山羊背最長肌及半膜肌cDNA混合樣作為模板進行PCR擴增得到產(chǎn)物長度為835 bp（圖2-A），TA克隆后隨機挑選單克隆菌落接種菌液并PCR擴增測序（圖2-B），根據(jù) NCBI在線BLAST比對獲得了山羊TNNT3基因CDS區(qū)5種基因可變剪切體（圖2-C）：、、、和，5種不同可變剪切體的開放閱讀框編碼起始位點（ATG）與編碼終止位點（TAG）均一致，且特異性地表達了互斥外顯子Exon 16/17。另外，的外顯子Exon 9—11出現(xiàn)了138 bp的重復（圖2-D），這一外顯子的重復插入使得的開放閱讀框加長，增加了46個氨基酸殘基（圖2-E），其余4個轉(zhuǎn)錄本均不同程度地缺失了個別外顯子，但結構域均未發(fā)生改變（圖2-F）。NCBI工具ORF Finder預測開放閱讀框的長度分別為741、753、783、801和954 bp，其編碼的氨基酸序列長度從246 AA 到317 AA，蛋白質(zhì)分子量（kD）從29.17到37.40，蛋白質(zhì)等電點（pI）范圍從6.72到9.15（表2）。

從NCBI上下載其他物種氨基酸序列并利用MEGE 10.1.8構建進化樹（圖3），發(fā)現(xiàn)山羊氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育進化關系最近的有哺乳動物牛（）、驢（）、豬（）和人（），而與爬行類（）和鳥類（）的同源關系較遠。此外，山羊基因核苷酸序列在哺乳動物中高度保守，例如，山羊和轉(zhuǎn)錄本序列與綿羊、藏羚羊、牛、豬、狒狒、小鼠和兔子的基因序列相似性分別為99%、98%、98%、97%、95%、95%及91%；TNNT3_2和TNNT3_5轉(zhuǎn)錄本與綿羊、牛、豬、人和小鼠的相似性也較高性（分別為99%、99%、95%、96%及91%，但轉(zhuǎn)錄本序列與綿羊（94%）、藏羚羊（93%）、牛（94%）、豬（92%）、狒狒（94%）、小鼠（94%）的相似性則相對較低。

A：TNNT3 CDS區(qū)全長PCR產(chǎn)物(P1:835bp)；B：TNNT3可變剪切體單克隆菌液PCR產(chǎn)物；C：TNNT3可變剪切體差異片段（exon4-8：193-253 bp）qPCR產(chǎn)物；M1：DNA marker DL 2000 bp；M2: DNA marker DL 5000 bp；D：TNNT3不同可變剪切體序列與山羊全基因組數(shù)據(jù)庫比對結果，紅色方框是發(fā)生可變剪切的外顯子位點；E：山羊TNNT3不同可變剪切體的氨基酸序列對比；綠色方框：骨骼肌中最先被降解的產(chǎn)物[18]；紅色方框：TNNT3_3的外顯子Exon 9—11重復，增加了46個氨基酸殘基；藍色方框：互斥表達的外顯子16/17編碼的氨基酸[25]；F：TNNT3可變剪切體結構域預測

表2 山羊TNNT3不同可變剪切體預測的氨基酸序列信息

圖3 TNNT3氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進化分析

2.2 山羊TNNT3基因的組織表達分析

利用熒光定量及半定量PCR檢測出生后3d的羔羊心、肝、脾、肺、腎以及背最長肌和半膜肌組織中mRNA水平表達，發(fā)現(xiàn)熒光定量（圖4-A）及半定量（圖4-B）結果一致：mRNA在檢測的7個組織中都有表達，其中在背最長肌及半膜肌中的表達最高（<0.01），心臟及肺次之（<0.01），其余組織中的表達量相對較低（>0.05）。

2.3 山羊TNNT3不同轉(zhuǎn)錄本在胚胎期及出生后不同發(fā)育階段的表達分析

根據(jù)上述的組織表達結果，選擇簡州大耳羊在胚胎期（E75、E90和E105）和出生后（B3、B45、B150和B300）兩個時間段共7個時間點的背最長肌（LD）和半膜肌（SM）檢測mRNA基因表達（圖4-C）。背最長肌和半膜肌組織中mRNA均呈現(xiàn)“下降-上升-下降”的表達趨勢。在胚胎期LD和SM中均是E75相對表達量高于其余兩個胚胎時間點（E90和E105），且在半膜肌的表達量高于背最長肌；出生后45 d在背最長肌的表達量高于半膜肌，B150達到峰值，顯著高于B3和B45的表達量（<0.01）。此外，隨著山羊日齡增長轉(zhuǎn)錄本數(shù)量減少，在B150和B300山羊LD和SM中不能明顯區(qū)分多種轉(zhuǎn)錄本（圖4-D），說明各轉(zhuǎn)錄本可能在山羊胚胎期肌肉生長發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用。

A: TNNT3在不同組織中的mRNA水平；B: TNNT3可變剪切體在不同組織中的半定量電泳結果；C: TNNT3在背最長肌和半膜肌不同發(fā)育階段中的mRNA水平；D: TNNT3可變剪切體在背最長肌（LD）和半膜肌（SM）不同發(fā)育階段中的半定量電泳結果；圖中所標不同字母表示差異極顯著（P<0.01）；同一時期兩組織間的表達差異顯著性用*（P<0.05）**（P<0.01）表示

2.4 TNNT3_3的TNT檢測及過表達

為了初步探究對肌細胞分化的影響，筆者在鑒定出的5種轉(zhuǎn)錄本中選取與其他物種序列相似性最低的, 首先成功構建體外轉(zhuǎn)錄翻譯載體（圖5-A），確定了具有轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白的能力且蛋白大小與預期基本相符（圖5-B）。進一步在山羊MuSCs中將轉(zhuǎn)錄本過表達，分別檢測增殖期（GM）和分化期（DM）基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，雖然過表達使增殖期細胞中表達水平提高上萬倍，但、和表達量差異不顯著，而mRNA水平約上升1.5倍（<0.05，圖5-C GM）；而在分化條件下，肌分化標志基因、和相較于對照組均極顯著升高（<0.01），增殖相關基因表達仍未改變（圖5-C DM）。與此相對應，過表達后誘導分化7 d免疫熒光檢測MyHC信號，發(fā)現(xiàn)可以明顯促進MyHC表達和肌管形成（圖5-D）。

3 討論

利用并整合其他哺乳動物已報道TNNT3基因序列，成功地克隆分離了山羊肌肉組織TNNT3基因的5個可變剪切體。同時，根據(jù)氨基酸序列構建的系統(tǒng)進化樹表明，山羊與綿羊和牛的氨基酸序列高度相似，歸屬于哺乳動物。值得注意的是，比對結果顯示雖然、、、外顯子均有不同程度的缺失，但開放閱讀框的起始位點及結束位點均一致，這也證明了TNNT3基因在哺乳動物中序列高度保守的結論。在牛肌肉組織的免疫鑒定中發(fā)現(xiàn)一個TNNT的片段（31—32kD的多肽鏈）ASPPPAEVPEVHEEVH是骨骼肌中最先被降解的產(chǎn)物，伴隨這個降解發(fā)生的是肉質(zhì)嫩化的過程[18]。在克隆獲得的山羊序列中也發(fā)現(xiàn)了這個片段，但5和2部分或完全缺失該片段，該片段的缺失對肌肉生長發(fā)育及肌肉降解的作用以及是否會影響肉質(zhì)產(chǎn)品的風味還需進一步探索。在與山羊TNNT3基因的其他可變剪切體進行差異比對和分析時筆者發(fā)現(xiàn)TNNT3基因核酸序列在外顯子缺失位點的兩端，A、G含量高且多為重復序列，推測這可能是造成不同剪切形式的原因。這個推測與現(xiàn)代內(nèi)含子的剪切模式研究觀點相同[26]，并且基因序列中出現(xiàn)了較多類似的回文結構，這也可能是造成了剪切識別位點錯位的原因。

A：TNNT3_3體外轉(zhuǎn)錄載體構建；B：TNNT3_3體外轉(zhuǎn)錄蛋白免疫印跡結果；C：TNNT3_3過表達后增殖GM/分化DM時期標志基因mRNA水平；D：分化7 d后MyHC免疫熒光結果；M1：DNA marker DL 2000 bp；M2：DNA marker DL 5000 bp；M3：蛋白marker

肌鈣蛋白復合物的3個亞基中的每一個都有多種亞型，這些亞型以不同的組織特異性和發(fā)育調(diào)控模式表達。在人和小鼠中TNNT3基因由19個外顯子構成，包含編碼271個氨基酸的CDS區(qū)。N末端編碼的外顯子4、5、6、7和8可發(fā)生約幾十種選擇性剪接[27-28]，外顯子8和9之間的胎兒外顯子也可以剪切并在胚胎快速骨骼肌中獨特表達[29]，C末端與中間區(qū)域高度保守。C端的外顯子16和外顯子17是在生長發(fā)育過程中的剪切調(diào)控中相互排斥的[25]，這兩個外顯子共同編碼TnC與TnI結合位點的14個氨基酸殘基的多肽片段（圖1）[28]。通過cDNA序列比較，外顯子16主要在成年的快速骨骼肌肌鈣蛋白內(nèi)表達。而外顯子17所編碼的氨基酸序列與慢骨骼肌肌鈣蛋白（ssTnT）和心肌肌鈣蛋白（cTnT）中的氨基酸序列具有較高的相似性，并主要在胚胎期以及新生兒的快速骨骼肌肌鈣蛋白（）中表達。并且，蛋白質(zhì)相互作用研究表明，外顯子17的摻入減弱了快速骨骼肌肌鈣蛋白中TNNC與原肌球蛋白的親和力[30]。

TNNT3基因已知可以調(diào)節(jié)快速骨骼肌的收縮，但其在肌肉中的具體作用仍存在爭議。為確定其在體內(nèi)的功能，有研究構建了TNNT3/flox/lacZ小鼠，結果發(fā)現(xiàn)，TNNT3小鼠體型在整個發(fā)育過程中都比野生型小，TNNT3胚胎比雜合子小，并在出生后不久死亡。總的來說，這個研究表明在肌肉中表達是肌肉生長發(fā)育所必需的，并且是正常生長和新生小鼠產(chǎn)后呼吸生存所必需的[10]。飲食特異性對pre-mRNA選擇性剪接的影響是由高脂豬油飲食中特定類型的脂肪酸或神經(jīng)酰胺在肌肉內(nèi)的積累引起的[9]。如PP1對于神經(jīng)酰胺誘導的Bcl-xL和caspase-9 pre-mRNAs[31]替代剪接的改變是必要的。其他研究也報道了飲食或肥胖導致的pre-mRNA選擇性剪接的變化[32-34]，但控制代謝的激素反饋使體內(nèi)調(diào)節(jié)選擇性剪接的機制復雜化，并且對于特定脂肪酸在這一過程中的作用目前知之甚少。此外，因為承重肌肉會收到關于體重的機械反饋，并消耗ATP以產(chǎn)生足以抵消重力的能量。有研究利用大鼠研究了體重的變化如何影響的選擇性剪接，但結果發(fā)現(xiàn)其剪接形式與夜間能量消耗顯著相關，而與自身體重無關[34]，這一結果也進一步證實通過協(xié)調(diào)肌絲的鈣離子濃度依賴性ATP酶活性，從而在肌細胞收縮和舒張過程中發(fā)揮作用。

本研究以簡州大耳羊為研究對象，實時熒光定量檢測其組織表達結果顯示，mRNA在肌肉組織中表達最高，且在出生前后均處于較高的表達水平。肌纖維的發(fā)育可分為4個階段：中胚層干細胞分化為成肌細胞，成肌細胞融合為肌管細胞，肌管細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧±w維，最后肌纖維生長至成熟。大多數(shù)動物肌纖維發(fā)育的前三個過程在動物胚胎期就己完成，肌纖維數(shù)目也在出生前就已確定[35-37]。動物骨骼肌在生長發(fā)育過程中，其肌纖維組成類型并不是完全固定的，肌纖維類型經(jīng)過一個成熟過程以達到成年的分布模式，特別是在動物出生早期，肌纖維的收縮和代謝特性會隨著骨骼肌對代謝與功能需求的改變而發(fā)生轉(zhuǎn)變。本試驗結果中，mRNA在背最長肌和半膜肌中的表達始終處于一個動態(tài)變化中。半膜肌屬于I型肌纖維又稱慢收縮型肌纖維，具有收縮緩慢的特性；這種類型肌纖維含有豐富的線粒體，表現(xiàn)出更強的氧化代謝能力，在耐力型工作中發(fā)揮主導作用。背最長肌主要是II型纖維又稱快收縮型纖維，具有收縮速度快、易疲勞的特性；這種類型的肌纖維主要在強度要求高、速度要求快的運動中發(fā)揮作用。定量結果顯示出生后半膜肌中mRNA的表達持續(xù)下降，背最長肌中mRNA的表達持續(xù)上升，并在快速發(fā)育以及成年階段背最長肌中的表達都極顯著高于半膜肌，且在150 d達到了峰值，這個結果符合TNNT3基因目前已知的生物學功能及表達特性。目前許多的資料表明，運動、激素、神經(jīng)刺激、不同生理狀態(tài)等均可引起不同程度的骨骼肌肌纖維類型的轉(zhuǎn)變[23]。小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，TNNT3是產(chǎn)后及生長的肌肉中所必需[10]，在C2C12中的表達量和可變剪切體的形式隨著肌管分化逐漸增加[11]，表明TNNT3在肌肉生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的生物學功能。在發(fā)育過程中，TNNT3基因各轉(zhuǎn)錄本的表達在骨骼肌中經(jīng)歷了高分子量至低分子量的剪接形式轉(zhuǎn)換[38]，該轉(zhuǎn)換也代表了低等電點結合形式向高等電點形式的轉(zhuǎn)變，本研究也有類似的結果（圖4）。目前對于可變剪切體的研究集中在人和小鼠，不同的可變剪切體通過編碼出不同肌鈣蛋白亞型發(fā)揮生理作用。如可能與遠側(cè)關節(jié)的攣縮有關，但其具體的生物學效應目前還不明確[1, 39-40]。在人的肌肉萎縮研究中發(fā)現(xiàn)，的缺乏不影響剪接形式的發(fā)育轉(zhuǎn)換，這表明pre-mRNA的選擇性剪接與骨骼肌纖維類型無關[38]。此外，已有研究證明，雖然的N末端可變區(qū)不與細絲調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的任何已知蛋白質(zhì)結合，但的N末端片段中的選擇性剪接已經(jīng)顯示出對TNNT3蛋白的總體構象以及對TNNI和原肌球蛋白的結合親和力的影響[41]。

4 結論

在山羊上成功獲得五種可變剪切轉(zhuǎn)錄本的CDS序列，山羊TNNT3基因與綿羊、牛、豬等哺乳動物具有很高的相似性，與魚類爬行類動物一致性較低，證明TNNT3基因序列在哺乳動物中高度保守。主要在肌肉組織（背最長肌和半膜肌）中高表達，并且過表達后可以促進山羊MuSCs分化，表明在肌肉生長發(fā)育中具有潛在的重要生物學功能。

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Alternative Splicingand Its Effect on the Differentiation of MuSCs in Goat

CHEN Yuan, CAI He, LI Li, WANG LinJie, ZHONG Tao, ZHANG HongPing*

Farm Animal Genetic Resources Exploration and Innovation Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130

【Objective】As a member of the troponin (Tn) family,(Fast Skeletal Troponin T3) involves skeletal muscle contraction, growth, development, and even meat characteristics of domestic animals.This study initially aimed to identify the alternative splicing of goat ().【Method】Based on goat(NM_001314210.1) and cattle(XM_010821200) mRNA sequence from NCBI (National Center for Biotechnology Information), the primers were designed by using the Primer Premier 6.0 software, subsequently, TNNT3 was amplified from skeletal muscles of embryo Jianyang Bigear Goat.The obtainedsequences were then bioinformatically analyzed by using ORF Finder, EditSeq, DNAMAN, ClustalW, and MEGA_X_10.1.8.Furthermore, the levels ofisoforms were quantified by using real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) and semi-quantitative PCR in longissimus dorsi (LD) muscle, semimembranosus (SM) muscle, heart, liver, spleen, lung, and kidney, at seven stages (E75, E90, E105, B3, B45, B150, and B300), respectively.Additionally, the coding ability of transcript【Result】① A total of five isoforms (named) of thegene were identified in pooled RNA extracted from goat muscles, and the complete coding sequence (CDS) sequence mainly contained 18 exons.② Nucleotide sequence and amino acid sequence of the goatgene were highly consistent with sheep, cattle, pig, and other mammals, but low with that of fish and reptiles, indicating the high evolutionary conservation of thegene in mammals.③ ThemRNA was presented in all seven detected tissues but highly enriched in LD and SM muscles (< 0.01), followed by cardiac muscle and lung.Furthermore, the levels ofmRNA in SM muscles were higher than that in LD muscles in prenatal goats (< 0.05), while the verse results were presented postnatal (< 0.05).④ The conserved exon 9-11 (138 bp) of goatwas repeated in the transcript.was amplified, and it was found out that which could encode protein, and the protein size was basically the same as expected (37 kDa) in TnT transcriptional translation system in vitro.Moreover, the transfection ofinto goat MuSCs induced mRNA levels of myogenic differentiation marker genes, including Myomaker, MyoG, and MyH4, comparing with the control (< 0.01).【Conclusion】Five isoforms with complete CDS region of thegene were obtained in goat muscles.The sequence and expression ofwere highly conserved in mammals and enriched in muscles, indicating that potentiallygene functions critically in muscle growth and development.

goat;; alternative splicing; quantitative PCR; TnT transcriptional translationWestern blotting; myogenic differentiation

2020-09-09；

2021-05-13

國家自然科學基金（31672402，31772578）

陳媛，E-mail：Chyuan201301@163.com。通信作者張紅平，E-mail：zhp@sicau.edu.cn

（責任編輯 林鑒非）