高產β-葡萄糖苷酶酵母菌的誘變選育及對刺梨果酒香氣特性的影響

劉曉柱，張遠林，李銀鳳，于志海，黃名正

（貴州理工學院食品藥品制造工程學院，貴州貴陽 550000）

刺梨（Rosa roxburghiiTratt）是一種兼具營養價值和藥用價值的薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）植物，廣泛分布于我國西南地域，如貴州、四川、重慶等[1]。目前對刺梨的研究主要集中活性成分[2]、香氣特性[3]以及基因功能[4]等領域的研究，而對刺梨微生物資源的篩選、鑒定及應用等方面的研究還比較少。謝丹等[5]、劉曉柱等[6]采用高通量測序方法分析了刺梨果渣自然發酵過程中細菌群落結構和多樣性的變化；劉曉柱等[7]結合了高通量測序技術鑒定了刺梨自然發酵過程中非釀酒酵母多樣性變化，并采用純培養技術從中分離到5 類可培養非釀酒酵母菌。趙湖冰等[8]、劉曉柱等[9]則深入分析了刺梨葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）的生理特性，并采用混合接種形式進行了刺梨果酒的發酵，發現接種刺梨野生酵母影響刺梨果酒的基本理化特性，并可調節刺梨果酒的香氣特性。上述研究表明，刺梨果實上蘊含著豐富的微生物資源，亟待進一步深入的研究。

揮發性風味物質的種類及其含量是食品飲料的一項重要評價指標[10?11]。然而水果中的一些風味物質通常以穩定的前體形式存在，只有這些風味前體物質被水解，其芳香類配體風味物質才能被釋放出來[12]。β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）是一類可水解含β-D-葡萄糖苷鍵底物的水解酶，能夠釋放出具有香氣特性游離糖苷配體，促進香氣物質的產生，被廣泛用于果汁、果酒等食品領域的增香[13?15]。β-葡萄糖苷酶普遍存在于微生物細胞中，具有酶活性高、底物特異性強、易純化等特點，近年來受到廣泛的關注[16]。但目前分析β-葡萄糖苷酶對刺梨果酒香氣特性影響方面的研究還比較少。

課題組前期從“貴農五號”刺梨果實上分離保存的酵母菌資源庫中篩選到一株產β -葡萄糖苷酶異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。化學誘變因其誘變率高、操作簡單而被廣泛用于各類微生物的選育研究中[17]。本研究采用化學誘變方法對一株產β-葡萄糖苷酶W.anomalus菌株進行化學誘變，進一步提高其β-葡萄糖苷酶活性。將該菌株及其誘變高產β -葡萄糖苷酶菌株用于發酵刺梨果酒，頂空固相微萃取-氣相質譜聯用法檢測刺梨果酒揮發性香氣成分，進而分析β -葡萄糖苷酶對刺梨果酒香氣特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

W.anomalusC4 菌株分離于“貴農五號”刺梨，保存于本實驗室;釀酒酵母ZYMAFLORE X16（S.cerevisiaeX16） 法國LAFFORT 公司；對硝基苯基-β-D 吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-D-glucopyranoside，p-NPG）、對硝基苯酚木糖苷（p-nitrophenolxyloside，p-NPX）、對硝基苯酚阿拉伯呋喃糖苷（pnitrophenolarabinoglycoside，p-NPAG）、對硝基苯酚鼠李糖苷（p-nitrophenolrhamnoside，p-NPR）、甲基磺酸乙酯（ethylmethanesulfonate，EMS）、環己酮 分析純，上海源葉生物科技有限公司；果膠酶（食品級，500 U/mg）、偏重亞硫酸鉀（食品級）、蛋白胨、酵母粉、葡萄糖以及其它常規試劑 試劑純，貴州博奧瑞杰生物科技有限公司。

GR60DA 型高壓蒸汽滅菌鍋 北京盛科信德科技有限公司；H5300 型紫外分光光度計 日本日立公司;雷磁PHSJ-3F 型pH 儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；ZD-85A 型恒溫搖床 常州朗越儀器制造有限公司；DHP-420 型恒溫培養箱 天津天泰儀器有限公司；SA402B 型電子舌味覺分析系統 日本INSENT 公司;TQ8040NX 型氣相質譜聯用儀日本島津儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 YPD 培養基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，固體培養基另加入瓊脂粉20 g/L，pH 自然，115 ℃，0.1 MPa 滅菌30 min，備用。

馬鈴薯葡糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 自然，115 ℃，0.1 MPa 滅菌30 min，備用。

1.2.2 菌株活化 將?80 ℃保存的W.anomalusC4菌株、S.cerevisiaeX16 菌株劃線于YPD 固體培養基，28 ℃恒溫倒置培養48 h，4 ℃保存，用于菌株的誘變及刺梨果酒的發酵。

1.2.3 生長曲線測定 菌株生長曲線的測定參考劉曉柱等[9]方法，以S.cerevisiaeX16 菌株為對照，每組平行重復3 次。

1.2.4 菌株化學誘變 取對數生長期的W.anomalusC4 菌株培養液，4000 r/min 離心收集菌體細胞，生理鹽水洗滌2 次，菌體細胞懸浮于生理鹽水中使其濃度為108CFU/mL。

參考溫智慧等[18]方法對W.anomalusC4 菌株進行化學誘變。取制備好的W.anomalusC4 菌懸液，加入EMS 使其終濃度分別為0%、1%、2%、3%。28 ℃溫育1 h。4000 r/min 離心收集細胞，棄上清至廢液收集瓶中。重懸細胞于5%硫代硫酸鈉溶液中，洗滌2 次，然后再把菌體懸浮于生理鹽水中，并稀釋成10?1～10?5濃度，涂布于YPD 固體培養基上，28 ℃恒溫倒置培養48 h，計算EMS 誘變致死率。致死率（%）=（對照組菌落數?處理組菌落數）/對照組菌落數。

1.2.5 突變菌株篩選 初篩：將EMS 誘變后的W.anomalusC4 菌株單克隆，挑至以p-NPG 為底物的96 孔板PDA 培養基中，28 ℃培養72 h，加入1 mol/L Na2CO3終止反應，觀察各孔顯色情況，挑選顏色較深的菌落繼續進行復篩檢測。

復篩：挑取初篩顯色較深的W.anomalusC4 菌株單克隆至YPD 液體培養基中，28 ℃，180 r/min 培養72 h，4000 r/min 離心收集上清液，作為粗酶液，用于測定菌株糖苷酶活性。

1.2.6 糖苷酶活性測定β-葡萄糖苷酶活性測定按照參考文獻方法[19]進行。酶活力單位（U）定義為pH5.0、50 ℃條件下，1 min 水解p-NPG 產生1 μmol p-NP 所需酶量。

分別取300 μL 粗酶液于1.5 mL 離心管中，a.加入100 μL p-NPX、37 ℃反應1 h，加入1 mol/L Na2CO3終止反應，靜置5 min，400 nm 處測定OD 值，計算菌株β-D-木糖苷酶活性；b.加入300 μL p-NPAG 底物溶液，37 ℃反應30 min，加入1 mol/L Na2CO3終止反應，靜置15 min，405 nm 處測量OD 值，計算菌株α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性；c.加入150 μL p-NPR，45 ℃水浴保溫20 min，加入 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應，靜置15 min、測量OD405值，計算菌株α-L-鼠李糖苷酶活性。

相對酶活（relative enzyme activity,REA）計算如公式1 所示：

式中：EAs，各實驗組酶活；EAc，各對照組酶活。

突變菌株的酶活測定實驗中，以突變前菌株的酶活為對照；

1.2.7 菌株遺傳穩定性實驗 將誘變后產β-葡萄糖苷酶菌株接種于YPD 液體培養基中，連續培養8 代，每一代培養條件為：28 ℃，180 r/min，培養72 h，以第一代菌株的酶活為對照，按照1.2.6 方法測定各代菌株β-葡萄糖苷酶的相對活性。

1.2.8 不同酵母菌發酵刺梨果酒的制備 取新鮮成熟刺梨，榨汁，加入100 mg/L的偏重亞硫酸鉀、20 mg/L的果膠酶過夜處理，加入白砂糖調整糖度至24°Brix，分成五組，置于2 L 無菌三角瓶中，每組平行重復三次。第一組（S.cerevisiaeX16 組）：接種107CFU/mL的S.cerevisiaeX16；第二組（W.anomalusC4 組）：接種108CFU/mL的W.anomalusC4 酵母；第三組（W.anomalusE3 組）：接種108CFU/mL的W.anomalusE3酵母；第四組（S.cerevisiaeX16+W.anomalusC4 組）：同時接種108CFU/mL的W.anomalusC4 菌株和107CFU/mL的S.cerevisiaeX16；第五組（S.cerevisiaeX16+W.anomalusE3 組）：同時接種108CFU/mL的W.anomalusE3 菌株和107CFU/mL的S.cerevisiaeX16 菌株。各組于25 ℃恒溫靜置發酵。發酵結束后，取刺梨原酒，5000 r/m 離心10 min，取上清用于各種指標檢測。

1.2.9 刺梨果酒相關指標的測定

1.2.9.1β-葡萄糖苷酶活性的測定 在刺梨果酒發酵過程中，于發酵第0、2、4、6、8、10、12、14、16 d 分別取樣，以第10 d的酶活為對照，采用1.2.6 方法檢測刺梨果酒發酵過程中β-葡萄糖苷酶相對酶活的變化。

1.2.9.2 刺梨果酒基本理化指標的測定 刺梨果酒酒精度、總糖、總酸、揮發酸含量的測定采用酒類國際檢測分析方法進行[20]；pH 測定采用pH 計進行。

1.2.9.3 刺梨果酒感官特性的測定 量取各組刺梨酒80 mL，加入至電子舌專用燒杯中，按照電子舌系統儀器使用說明書對各組刺梨果酒進行檢測。采樣時間為120 s，采樣速度為1 次/s，每個樣品平行測定3 次，每個平行重復采集4 次[8]。

1.2.9.4 刺梨果酒揮發性香氣物質的測定[21]量取8 mL 各組刺梨果酒，加入1.0 g NaCl、50 μL 環己酮內標（273.5 mg/L），密封置于45 ℃水浴中，平衡30 min。插入固相微萃取頭對揮發性香氣成分進行頂空萃取，萃取結束后，將萃取頭插入GC 進樣口進行揮發性香氣成分的解吸附。

GC 條件：進樣口溫度240 ℃，進樣時間2 min，不分流進樣，載氣為氦氣，恒線速度模式（35 cm/s），吹掃流速3 mL/min，分流比20:1。色譜柱為InertCap Wax 毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），升溫程序40 ℃保持3 min，3 ℃/min 升至230 ℃，保持8 min。

MS 條件為：EI 離子源，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，全掃描模式（Q3 Scan），溶劑延遲2 min。

揮發性成分經GC-MS 分析后，通過與美國國家標準與技術研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）譜庫進行匹配，從而對揮發性成分進行定性分析；揮發性成分的定量分析采用內標法，計算公式如公式2 所示：

式中：As，內標物的峰面積；Ai，未知物的峰面積；ρs，內標物的質量濃度，μg/mL；ρi，未知物的質量濃度，μg/mL。

香氣活力值的計算：查閱各揮發性香氣成分閾值，計算各香氣成分風味活性值（odour activity value，OAV）。計算公式如公式3 所示：

式中：Ci為香氣成分質量濃度，μg/mL；OTi為香氣成分閾值，mg/L。

1.3 數據分析

Excel 2010 對數據進行處理和作圖；數據結果以平均值±標準差表示，SPSS 21.0 對數據進行顯著性分析；P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 菌株生長曲線

W.anomalusC4 菌株的生長曲線如圖1 所示，包含了適應期、對數生長期和穩定期。其中0～4 h 為適應期，4～20 h 為對數生長期，20 h 以后為穩定期。因此，本實驗選擇細胞生長旺盛的對數生長中期（12 h）進行EMS 化學誘變實驗。

圖1 W.anomalus C4 菌株生長曲線Fig.1 Growth curves of W.anomalus C4

2.2 誘變濃度的選擇

不同濃度誘變劑EMS 對W.anomalusC4 菌株致死率如圖2 所示，隨著EMS 濃度增加，菌株致死率增大。EMS 濃度為1%時，菌株致死率為81%，濃度為2%時，致死率達到93%，而3%的EMS 致死率達到100%。通常情況下，75%～85%的致死率，正突變率較高，有利于篩選到優良性狀菌株[22]。因此本研究選擇1%的EMS 作為誘變濃度。

圖2 不同濃度EMS 對W.anomalus C4 菌株致死率影響Fig.2 Effects of different concentrations of EMS on the fatality rate of W.anomalus C4

2.3 突變菌株的篩選

采用p-NPG 法對EMS 誘變的W.anomalusC4 菌株進行篩選，得到三株β-葡萄糖苷酶酶活性較高菌株，編號為D7、E3、F7的酶活為（48.96±0.95）、（55.05±0.74）、（54.25±0.26）U/L（圖3）。其中E3 菌株酶活最高，較出發菌株W.anomalusC4（41.80±0.25）U/L 提高了31.70%，因而選擇E3 菌株做后續分析。

圖3 三株突變菌株β-葡萄糖苷酶活性Fig.3 β-glucosidase activity of three mutant strains

與出發菌株W.anomalusC4 相比，EMS 誘變明顯提高了W.anomalusE3 菌株的β-葡萄糖苷酶活性。W.anomalusE3 菌株的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-D-木糖苷酶以及α-L-鼠李糖苷酶活性與親本W.anomalusC4 菌株相比，沒有顯著差別（圖4）。

圖4 W.anomalus E3 菌株糖苷酶活性分析Fig.4 Analysis of glucosidase production of W.anomalus E3 strain

2.4 突變菌株遺傳穩定性分析

將W.anomalusE3 菌株傳代培養，各代菌株β-葡萄糖苷酶活性如圖5 所示，菌株W.anomalusE3 傳至8 代，各代菌株的β-葡萄糖苷酶均保持著較高的活性，且與親本菌株W.anomalusC4 之間無顯著性差異，因此菌株產β-葡萄糖苷酶遺傳穩定性較好。

圖5 W.anomalus E3 菌株β-葡萄糖苷酶穩定性分析Fig.5 Stability analysis of β-glucosidase production of W.anomalus E3

2.5 W.anomalus E3 菌株對刺梨果酒品質影響

2.5.1β-葡萄糖苷酶活性變化 刺梨果酒發酵過程中，β-葡萄糖苷酶活性變化如圖6 所示，在發酵的前10 d，β-葡萄糖苷酶活性逐漸增加，第10 d 達到最大值。接著，β-葡萄糖苷酶活性迅速降低，直至發酵終點。我們的前期研究發現，低于10%（V/V）的乙醇可提高β-葡萄糖苷酶活性，而高于10%（V/V）的乙醇則抑制β-葡萄糖苷酶活性[23]。因而在刺梨果酒發酵第10 d，其發酵液中乙醇濃度可能為10%（V/V）左右，故β-葡萄糖苷酶活性達到最大值。隨著發酵的不斷進行，發酵液中乙醇濃度繼續增大，則反過來抑制β-葡萄糖苷酶活性。當然，其它因素也可能影響β-葡萄糖苷酶活性，如發酵液中葡萄糖也可調節β-葡萄糖苷酶的活性，隨著發酵的不斷進行，葡萄糖被不斷分解利用，其抑制效果逐漸被解除，β-葡萄糖苷酶活性逐漸增大，在發酵第10 d 葡萄糖等營養逐漸被耗盡，菌體活性受到影響，故而β-葡萄糖苷酶活性逐漸降低。

圖6 刺梨果酒發酵過程中β-葡萄糖苷酶活性變化分析Fig.6 Changes of β-glucosidase activity during the fermentation of Rosa roxburghii wine

2.5.2 刺梨果酒基本理化指標 各組刺梨果酒基本理化參數如表1 所示，接種W.anomalusC4、W.anomalusE3 可明顯降低發酵刺梨果酒的酸度值（總酸含量、揮發酸含量和pH）以及總糖含量。研究表明，接種純種W.anomalus可降低空心李果酒總酸含量，但混合接種發酵空心李果酒總酸含量則沒有明顯降低[21]。Ye 等[24]采用純種W.anomalus以及與S.cerevisiae混合發酵的蘋果酒（Cider）總酸含量也表現出明顯降低的特點。推測W.anomalus菌株具有降低發酵果酒酸度特性。

表1 刺梨果酒基本理化指標值Table 1 Physical and chemical indicators of R.roxburghii wine

2.5.3 刺梨果酒電子感官特性 各組發酵刺梨果酒電子感官特性結果如圖7 所示，除酸味值外，各組發酵刺梨果酒在苦味、澀味、后味、鮮味、豐富度以及咸味之間無區別。釀酒酵母發酵刺梨果酒酸度高于其它四組刺梨果酒。

圖7 刺梨果酒電子感官特性Fig.7 Electronic sensory properties of R.roxburghii wine

2.5.4 刺梨果酒揮發性香氣特性 采用HS-SPMEGC-MS 方法分析了各組刺梨果酒揮發性香氣物質種類與含量。S.cerevisiaeX16 發酵刺梨果酒中檢測到的揮發性物質種類最少，為26 種；接種W.anomalusC4 菌株或E3 菌株發酵刺梨果酒揮發性物質種類增多，W.anomalusC4 組、W.anomalusE3 組、S.cerevisiaeX16+W.anomalusC4 組、S.cerevisiaeX16+W.anomalusE3 組分別為46、47、56、48 種。

酯類化合物為各類發酵果酒中重要的香味物質，通常具有花香和水果香[25]。接種W.anomalus可顯著增加刺梨果酒中酯類香氣化合物的含量，其中接種純種W.anomalusE3 組刺梨果酒酯類香氣物質含量最高。乙酸乙酯是發酵果酒中最主要的酯類香氣化合物之一，具有菠蘿、甜果香味，閾值150 mg/L 左右[26]。在葡萄酒中，乙酸乙酯含量在80 mg/L 左右時，可較好的賦予葡萄酒水果香味，還可以增加酒體的復雜性。采用純種S.cerevisiaeX16 發酵生產的刺梨果酒中未檢測到乙酸乙酯，而四組接種W.anomalus發酵生產的刺梨果酒中乙酸乙酯含量均顯著增加，其中接種純種W.anomalusC4 發酵的刺梨果酒中乙酸乙酯含量最高，為（33.84±2.51）mg/L。研究表明，W.anomalus是乙酸乙酯良好的生產者，某些菌株合成的乙酸乙酯高達150 mg/L。乙酸乙酯的閾值為（150～200）mg/L，但過高濃度的乙酸乙酯則使得酒體具有腐敗特性[27]。本研究中，接種W.anomalus生產的刺梨果酒，其乙酸乙酯濃度為30 mg/L 左右，因而有助于增加刺梨果酒的水果香味特性。

醇類化合物由酒精發酵過程中，酵母菌代謝產生，對酒體的香氣特性具有重要影響[28]。接種純種W.anomalusC4、W.anomalusE3 菌株以及混合接種W.anomalusC4 菌株，均明顯提高了刺梨果酒中醇類香氣化合物的含量（圖8）。但混合接種W.anomalusE3酵母，發酵刺梨果酒中醇類香味化合物未顯著提高。

圖8 刺梨果酒揮發性香氣化合物含量Fig.8 Volatile aroma compounds contents of R.roxburghii wine

研究表明，提高β-葡萄糖苷酶活性可促進萜烯類化合物的釋放[29]。本研究發現，與親本W.anomalusC4菌株（0.83±0.05）mg/L 相比，化學誘變提高β-葡萄糖苷酶活性，可使W.anomalusE3 菌株（1.16±0.09）mg/L發酵刺梨果酒中芳樟醇含量提高。但接種產β-葡萄糖苷酶菌株（W.anomalusC4、E3）發酵的刺梨果酒中僅檢測到芳樟醇這一種萜烯類化合物，未發現其它類的萜烯類化合物，其原因還需要做進一步的分析。

此外，接種純種W.anomalusC4 菌株、混合接種W.anomalusC4 菌株明顯提高發酵刺梨果酒中其它類化合物的含量。因而接種W.anomalusC4 菌株、E3菌株顯著可增加刺梨果酒中揮發性酯類、醇類以及其它類物質含量，降低揮發性酸類物質含量（圖8）。

進一步分析各組發酵刺梨果酒的主要風味化合物OAV 值，從而評價不同發酵方式對刺梨果酒香氣特性貢獻度[30?31]。OAV 大于1 時，表明該化合物對酒體香氣貢獻度突出，反之OAV 小于1，該化合物對酒體香氣貢獻度不突出[15]。S.cerevisiaeX16 純種發酵刺梨果酒OAV 大于1的化合物為12 種，接種W.anomalusC4 菌株發酵刺梨果酒OAV 大于1的化合物為18 種，接種W.anomalusE3 菌株發酵刺梨果酒OAV 大于1的化合物為18 種，共同接種S.cerevisiaeX16 與W.anomalusC4 菌株發酵刺梨果酒OAV 大于1的化合物為18 種，共同接種S.cerevisiaeX16 與W.anomalusE3 菌株發酵刺梨果酒OAV 大于1的化合物為16 種。與接種S.cerevisiaeX16 組相比，接種W.anomalus可顯著增加芳樟醇、正己醇、乙酸異戊酯、乙酸乙酯、乙酸己酯等香氣化合物的OAV。相反，乳酸乙酯化合物的OAV 在接種W.anomalus組中明顯降低表2。

表2 不同酵母發酵刺梨果酒主要風味化合物OAV 值Table 2 The odour activity values（OAVs）for main compounds of R.roxburghii wine fermentation with different yeasts

3 結論

采用化學誘變劑甲基磺酸乙酯，誘變得到一株產β-葡萄糖苷酶性能穩定，酶活為（55.05±0.74）U/L的突變菌株W.anomalusE3。與W.anomalusC4菌株相比，W.anomalusE3 菌株酶活提高了31.70%。在刺梨果酒發酵過程中，W.anomalus β-葡萄糖苷酶活性逐漸增大，第10 d 達到最大值，然后迅速降低。接種W.anomalusC4、及其突變菌株E3 可降低刺梨果酒包括總酸含量、揮發酸含量、pH 在內的酸度值以及總糖含量；同時還可增加刺梨果酒中揮發性酯類、醇類物質的種類和含量以及主要香氣成分風味活性值（OAV）。因此，接種產β-葡萄糖苷酶W.anomalus菌株有助于調節刺梨果酒的香氣特性，增加刺梨果酒的復雜性和豐富度。