果蔬保鮮中拮抗菌生物防治研究進展

羅奉奉 ，付 躍 , ，蔣淑嫻，何海燕,

（1.河池學院化學與生物工程學院，廣西河池 546300；2.微生物及植物資源開發利用廣西高校重點實驗室，廣西河池 546300）

果蔬營養豐富，在人民日常飲食結構中占有重要地位，但果蔬生長、流通和銷售常常會受氣候與地域限制，果蔬采摘后仍然進行著旺盛的代謝活動，且在采摘、貯藏、運輸、加工、銷售等環節都可能受到機械損傷、微生物侵染等，致使果蔬腐爛變質。數據顯示，我國作為一個水果產量大國，居民主要以鮮食水果為主，水果采后貯藏能力僅為20%左右，遠低于發達國家；另外蔬菜采收后粗放的加工和儲存方式，也極易造成腐敗，因此每年因果蔬采后腐爛造成了巨大的經濟損失[1?2]。人們也采用了多種方法應對果蔬采后儲存保鮮，然而物理方法防治果蔬病害遠遠達不到人們所需要的效果，而使用化學殺菌劑控制延緩果蔬的腐爛進程，雖然效果顯著，但長期使用會帶來諸多問題，如使病原菌產生抗藥性、環境污染、化學殘留等[3]。生物防治作為一種安全健康的應對果蔬保鮮問題的新途徑，受各國研究者重視，其中拮抗菌生物防治安全且對生態發展更友好，成為了果蔬病害防控研究的熱點[4?6]。

本文主要針對拮抗菌的作用機制及篩選途徑等方面介紹近年來拮抗菌在果蔬保鮮方面的研究進展，旨在加深對拮抗菌在果蔬保鮮研究情況的了解，為未來果蔬保鮮的保鮮劑開發研究提供思路和參考。

1 拮抗菌的作用機理

拮抗菌生防作用機理十分復雜，受諸多因素的影響，涉及到拮抗菌、病原菌和果蔬之間的相互作用，以及果蔬貯藏期間的溫度、水分、pH、氧化等因素。大體上拮抗菌的防治保鮮機理有以下幾種方式。

1.1 競爭生長

拮抗菌首要作用機理為競爭生長，通過對營養物質（碳水化合物、維生素、氨基酸等）、生長空間（氧氣）的有效競爭，使之定植成為優勢物種發揮拮抗作用。不同濃度的拮抗菌對病原菌孢子萌發和菌絲生長有不同程度的抑制作用，表明拮抗菌與腐敗菌存在營養和空間的競爭[6]；如產黃假單胞菌（Pseudomonas synxantha）DLS65[7]通過競爭營養和空間，明顯抑制桃果病原菌（Monilinia fructicola,Monilinia fructigena）菌絲的生長，降低桃果實褐腐病的發病率；拮抗酵母（Sporidiobolus pararoseus）Y16[8]能夠在葡萄傷口短時內利用該處營養快速生長繁殖，且在傷口部位形成細胞外多糖基質，占領營養空間，抑制病原菌黑曲霉（Aspergillus niger）的生長；德巴利氏酵母（Debaryomyces hansenii）[9]接種濃度在1×106CFU·mL?1時，與病原菌形成營養競爭，其對蔗糖、葡萄糖、果糖等碳水化合物利用效率更高，使番木瓜的炭疽病發病率下降了50%；Yu 等[10]鑒定了與營養競爭相關的基因，該基因來自于惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）JBC17，其在營養脅迫條件下通過產生外切聚磷酸酶和氨基肽酶競爭氮源，從而抑制柑橘青霉病菌（Penicillium digitatum）分生孢子的萌發。由此看出，拮抗菌通過營養物質的攝取占據的優勢可在一定程度上抑制致病菌的侵害，在空間競爭中，可快速生長或形成胞外多糖的優勢，可促進粘附到果實表面形成生物膜，比病原體更有效地利用有限的資源，是果蔬保鮮中為最為常見的微生物拮抗方式。

1.2 產生鐵載體

在微量營養素中，鐵（Fe3+）是病原菌生長和發病的關鍵元素，鐵幾乎對所有微生物的增長至關重要。而鐵載體是一種低分子量的化合物，能夠與鐵離子（Fe3+）形成緊密而穩定的復合物，在細胞膜上運輸鐵。拮抗菌通過生產鐵載體來競爭鐵和干擾病原菌的萌發、生長，可達到對病原的抑制作用[7,11]。如棘胞木霉（Trichoderma asperellum）BHU P-1 和蒼白桿菌屬（Ochrobactrumsp.）BHU PB-1 生產的鐵載體改善了由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici）引起番茄枯萎病[12]，紫色鏈霉菌（Streptomyces violaceusniger）AC12AB[13]在抵抗馬鈴薯瘡痂病中通過產生鐵載體可有效地降低病害嚴重程度和促進植物生長，Konsue 等[14]發現孢圓酵母（Torulaspora indica）DMKU-RP31、DMKU-RP35 和Pseudozyma hubeiensisYE-21 能夠對由色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）引起的芒果腐敗，及Papiliotrema aspenensisDMKUSP67 對盤長孢狀刺盤孢（Colletotrichum gloeosporioides）引起的芒果炭疽病起良好的拮抗作用，其中，這四種拮抗酵母均不同程度地產生鐵載體對抗這兩種真菌病原體。由此看出，拮抗菌產生鐵載體對鐵的消耗，使病原體產生對鐵缺乏的一系列生理應答，最終生長被抑制。

1.3 誘導防御酶

果蔬采摘后極易被病原感染，一些拮抗菌通過定殖誘導果蔬產防御相關酶或化合物等增強抗性，如Waewthongrak 等[15]的研究表明枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ABS-S14 能誘導柑橘黃皮組織中防御相關酶——過氧化物酶（POX）和l-苯丙氨酸解氨酶（PAL），兩種酶的積累防止指狀青霉（Penicilium digitatumSacc.）的侵染；解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）[16]刺激提升蘋果果實組織中的多酚氧化酶、過氧化物酶、幾丁質酶和L-苯丙氨酸解氨酶的活性，經蛋白質組學和轉錄組學分析得出，共有35 種蛋白質在解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）誘導下表達上調和下調，水楊酸（SA）與乙烯/茉莉酸（ET/JA）信號通路介導的防御反應相關基因表達增加，從而增強蘋果果實組織的防御反應；鎖擲酵母（Sporidiobolus pararoseus）Y16[8]能夠能夠在葡萄傷口或葡萄表面快速存活和增殖，促使酶相關基因表達，包括多酚氧化酶、過氧化氫酶、苯丙氨酸脫氨酶等，增強葡萄的抗氧化能力，保護宿主組織免受病原的氧化損傷。由此看出，一些拮抗菌的定殖可增強果蔬抵御病原的能力，通過誘導果蔬防御相關基因表達和增強酶活性，達到一定的生物防治作用。

1.4 形成生物膜

拮抗菌能夠成功定殖在果蔬表面或傷口處并進行繁殖，大多數情況依賴于微生物拮抗群體形成的以多糖、核酸、蛋白質為主要成分的水化膜[6]。酵母的生物膜拮抗研究中報道較多，Silvana 等[17]研究的白冬孢酵母（Leucosporidium scottii）At17、Liu 等[18]報道的檸檬形克勒克酵母（Kloeckera apiculata）34-9 均有產生生物膜的特性，能夠在果實或傷口處形成與病原菌隔離的屏障，其作用機制與果蔬所處的環境因素如低溫或某些化學物質（芳香醇等）的脅迫誘導有關，觸發拮抗菌粘附基因的表達，不同種類的酵母攜帶不同家族的黏附素，通過特異性細胞壁黏附糖磷脂肌醇（GPI）錨定蛋白介導，促使細胞識別、粘附、入侵和生物膜形成，對采后果蔬病害具有良好的防治效果。

1.5 分泌酶或揮發性化合物

拮抗菌通過寄生或分泌揮發性化合物等對致病菌產生影響，致其細胞畸變破裂而將其殺死。馮金龍等[19]用解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）S27 處理馬鈴薯炭疽病菌（Colletotrichum coccodes）、馬鈴薯立枯絲核病菌（Rhizoctonia solani）、馬鈴薯枯萎病菌（Fusarium tricinctum）后，通過顯微觀察，發現病原菌菌絲細胞出現不同程度的腫脹、膨大，形成泡狀物最后崩解，說明S27 對病原菌菌絲具有致畸、溶解等作用；Yang 等[20]的研究首次發現鏈霉菌屬（Streptomycessp.）產生的一種新的抗真菌素霉素N2 通過誘導活性氧類（ROS）的過量生成，對立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）造成嚴重的氧化損傷，且在一定濃度范圍內能顯著提高立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）菌絲內的幾丁質酶活性，誘導該菌細胞壁降解，從而導致病菌形態發生和自溶。另外，綠色木霉菌（Trichoderma virens）Tv-1 和Tv-2、哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）Thz-2、鉤狀木霉（Trichoderma hamatum）Tha-1[21]通過破壞辣椒疫霉（Phytophthora capsici）的細胞壁結構、增強脂質過氧化及降低致病因子酶活力等方式起拮抗作用，抑制率均達到90%以上，通過檢測丙二醛含量（反映膜脂過氧化的程度，考察細胞受脅迫嚴重程度的重要參數）、纖維素酶活力等判定木霉菌的殺菌機理；中間假絲酵母（Candida intermedia）C410[22]產生的49 種揮發性物質（酯類、醇類、烯烴類、烷烴類、有機酸類等）中乙酸乙酯、己酸乙酯等對草莓病原灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）分生孢子萌發和菌絲生長均有高度的抑制作用，灰霉病的發生率和嚴重程度明顯降低；綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）JS29[23]產生的生物表面活性劑在不同貯藏條件下均能有效抑制辣椒炭疽菌（Colletotrichumcapsici）的孢子和菌絲的生長；芽孢桿菌（Bacillussp.）對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和馬鈴薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）[24]、蘋果炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides、Colletotrichum acutatum）[25]、番茄灰霉病（Botrytis cinerea）[26]、桃褐腐病（Monilinia fructicola）[27]等病原菌的生長均具有抑制作用，拮抗作用與芽孢桿菌產氰化氫、幾丁質酶、葡聚糖酶、蛋白酶、真菌代謝物或揮發性物質等有關。拮抗菌對病原的抑制或殺滅作用，一方面可通過分泌一些酶如幾丁質酶、纖維素酶、蛋白酶、葡聚糖酶、木聚糖酶等破壞病原菌細胞壁結構，影響孢子萌發、菌絲生長；另一方面通過分泌抗生素、揮發性化合物或表面活性劑等促使病原菌細胞內部氧化，產生過量氧化產物，致使細胞損傷達到殺菌的目的。

1.6 防御基因表達

膜醭畢赤酵母（Pichia membranefaciens）[28]對桃樹根霉病的生防效果除了可誘導防御相關酶的活性，還可激活防御基因的表達，經轉錄組分析表明，MAPK 級聯信號通路和乙烯（ET）、茉莉酸酯（JA）和水楊酸（SA）的信號轉導通路可被拮抗酵母激活，介導下游防御相關基因包括PR 基因和谷胱甘肽S-轉移酶（GST）基因（即植物-病原體相互作用途徑和次生代謝物合成相關基因）的表達，提高桃的抗病能力。Muccilli 等[29]構建了表達幾丁質酶基因（chit42）的E23 轉基因檸檬，對檸檬采后灰霉病（Botrytis cinerea）有很好的抑制效果，代謝組學研究發現其與野生型克隆代謝特征有實質等效性，同時避免了化學殺菌劑的殘留和提高食品安全性，該研究證實了基因工程為柑橘特定病害的可持續有效管理開辟了新的前景。淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）[30]gCLA4 中壞死誘導蛋白（necrosis-inducing protein）4955 基因經克隆表達后，檢測其對煙草防御反應相關酶活和防御相關基因表達量的影響，發現該蛋白確實能夠提高煙草相關防御基因的表達，增強植物的防御反應。新的生物技術工具的發展，開啟了更精確、更快速的植物遺傳修飾的可能性[31]，不僅改良木本果樹品種的特定性狀，同時保持選定品種的一般性狀不變，保證了果樹及產品的理想品種，特別在生物防治病害方面，大大降低了果實采后的保鮮處理難題。

2 拮抗菌的篩選途徑

拮抗菌來源途徑較為廣泛，可以從根際土壤、果蔬根莖、葉子、果實等篩選分離，也可從一些極端環境中篩選，篩選具有高效拮抗力的菌株對果蔬采后病害控制至關重要。但拮抗菌篩選要盡量滿足兩個條件：一是果蔬所含內生菌中的優勢種或寄生效果良好；二要對保護的果蔬無不良影響。

2.1 植物體內生菌的篩選

植物內生菌對果蔬無毒無害、與其互利共生，因此已被大量研究證實植株體內生菌可用于生防[32]。以祁連山東部小嵩草分離出內生的解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）262AG6[33]對馬鈴薯炭疽病菌（Colletotrichum coccodes）的抑制率達到81.33%；從番茄植株的根、莖、葉和果實分離的內生菌BL1、BT5、BR8 和BF11 菌株[34]，用其對灰霉病病原真菌灰葡萄孢（Botrytis cinerea）進行拮抗試驗，發現4 株內生菌抑菌活性為27%～53%，經16S rDNA 測序表明該4 株內生菌與芽孢桿菌親緣并能分泌大量脂肽和多種抗生素，對灰葡萄孢（Botrytis cinerea）具有良好的拮抗作用，可用于植物病害的生物防治；從柑桔果實、花、葉中分離得到78 株酵母菌中[35]，經體外抗真菌活性測定，有16 株菌對指狀青霉（Penicilium digitatum）具有拮抗作用，15 株菌對柑桔綠霉病具有較強的生物防治能力，其中一株畢赤酵母屬菌株（Pichia galeiformis）BAF03 產生的8 種揮發性有機化合物對指狀青霉有明顯的抑制作用，對柑橘采后綠霉病具有一定的防治作用。

2.2 植物體表微生物的篩選

植物體表是病原菌入侵第一站，某些植物體葉、莖、根、果表面存在一些共生菌或互惠菌幫助植株抵御病原菌。根系表面微生物與根系內生菌不同，其直接接觸土壤與植物根表組織，常常定殖于根表形成保護膜，與內生菌相比更易分離得到。從芒果葉片和果實表面分離到GB28 菌株[36]使芒果采后自然感染膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioide）發病率降低70%；蘋果果皮分離的嗜油假絲酵母（Candida oleophila）L-06[37]產生的β-1,3-葡聚糖酶對蘋果采后擴展青霉（Penicillium expansum）的分生孢子萌發有抑制作用；Kasfi 等[38]從葡萄表面篩選并鑒定出5 株酵母菌和2 株芽孢桿菌，包括膜狀假絲酵母（Candida membranifasciens）等，對葡萄果實積累的黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）和褐黃曲霉菌（Aspergillus ochraceus）均有拮抗作用。這些在植物體表面篩選得到的拮抗菌均對本身的果實腐敗有一定的防治效果，但也有些拮抗菌的拮抗譜不局限于對本身果實的病原起拮抗作用，對其他果蔬病原也產生拮抗，如在中國北方采集的李子果實表面分離出的新種假絲酵母（Candida prunispnov.）[39]可以防治油桃果實上的褐腐病菌（Moniliniaspp.）引起的褐腐病，使褐腐病發生率降低到20%。

2.3 其他生境拮抗菌的篩選

除了從植株本身可篩選獲得拮抗菌，凍土、沼澤、海洋等也可以成為獲得拮抗菌的篩選來源，且篩選得到的拮抗菌生防效果不亞于果蔬植株來源。Silvana 等[17]從南極土壤中篩選得到一株耐冷酵母（Leucosporidium scottii）At17，對蘋果冷藏儲存發生的青霉病（Penicillium expansum）、灰霉病（Botrytis cinerea）有較好的防治效果，發病率下降分別至5%和3%（對照組發病率為99%）；Shen 等[40]在漳州紅樹林沼澤的泥中分離到一株擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）ZMY-1，當細胞濃度達到1×108CFU·mL?1時，對草莓灰霉病（B.cinerea）有明顯的抑制作用，在20 ℃ 和4 ℃ 條件下都能在傷口和草莓果實表面存活和生長，減少了貯藏過程中的自然腐爛且不影響果品；Wang 等[41]從中國東海中篩選得到的海洋紅酵母（Rhodosporidium paludigenum）在鹽脅迫濃度為6.6%情況下對梨的擴展青霉（Penicillium expansum）抑制最大，其存活率可能與海藻糖積累有關，得出一定的生理誘導使細胞在冷凍后仍表現更好的活力。除自然環境，在一些特定的與動植物生長相關的體內外環境中也可篩選得到拮抗菌，如Kim 等[42]從鹽生植物的根際區分離得到枯草桿菌（Bacillus subtilis）HM1 對蘋果炭疽病病原體尖銳炭疽菌（Colletotrichum acutatum）造成的病害降低了80.7%，經鑒定，HM1 產生的風霉素化合物在抗真菌活性中起著關鍵作用；另有從青藏高原傳統牦牛發酵乳中分離得到的保加利亞乳酸桿菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）F17 和乳酸明串珠菌（Leuconostoc lactis）H52[43]顯著抑制需氧中溫菌、酵母菌、霉菌和大腸菌群的生長和定殖，具有促進草莓生物保鮮的潛力；從海洋魚腸道分離出的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）S2-6、米酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）B2-4[44]對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、志賀氏菌（Shigella）等病原有不同程度的抑制作用，與其分泌的細菌素有關。

從上述可看出，果蔬植株與其體內、體表及周邊環境的拮抗微生物共存，成為拮抗菌的篩選良好途徑，但在一些特殊的環境中也可獲得發揮一定拮抗效力的拮抗菌，對病原作用效果也很明顯，開拓了果蔬拮抗菌的篩選來源。

3 常見拮抗菌在果蔬保鮮中的應用

3.1 細菌

芽孢桿菌是具有許多特殊功能的重要的資源微生物，可用于防治植物病蟲害、凈化水質、改善土壤環境、醫學科學及工農業等領域。研究發現其中有一些具有良好防控效果的果蔬保鮮拮抗芽孢桿菌：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis）[45?49]、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefacien）[50?55]、多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）[25,32,56]、短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）[57]、蘇云金芽抱桿菌（Bacillus thuringiensis）[58?59]等。芽孢桿菌代謝分泌的細菌素物質、脂肽類化合物、溶菌酶蛋白、有機酸類物質等能有效抑制病原菌的生長，或將致病菌溶解從而殺死致病菌及高抗重茬。

另有，假單胞菌屬拮抗菌的研究也有一定的成效，如嗜根寡養單胞菌（Stenophomonas rhizophila）能夠通過揮發性物質、營養競爭等抑制芒果炭疽病孢子的萌發[60]，可使炭疽病的發病率降低95%；熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）Pf1[61]能夠誘導芒果產生防御相關酶如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（PO）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）等，阻止病原菌在芒果果實中進一步入侵，防止果實貯藏期間腐爛；熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）ZX[62]有蛋白酶活性,產生具有抗真菌能力的鐵載體和揮發性有機化合物，可顯著減少柑橘青霉病灶的大小和發生率；Oniel 等[63]篩選的一種假單胞菌屬（Pseudomonasspp.），從中分離出抗真菌化合物對藍莓上的灰霉菌（Botrytis cinerea）和鏈格孢屬（Alternaria alternata）產生抑制，使藍莓果實腐爛發生率和嚴重度分別降低50%和64%；綠針假單胞菌（Pseudomonas choloeaphtis）HL5-4[64]抑制灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的菌絲生長和分生孢子萌發，萌發抑制率為70.74%，對番茄果實防治效果分別達到72.36%；還有銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）UFB2 對番茄潰瘍病致病菌密氏克拉桿菌（Clavibacter michiganensis）1-07 有良好抑制作用，基因組分析其有多個基因島編碼次生代謝物如2，4-二乙酰基間苯三酚與抗菌活性相關[65?66]；以及銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）BTLbbc-05[67]抑制辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）的孢子囊形成和游動孢子發生，導致游動孢子停止裂解達50%，為潛在的辣椒生防菌。由此看出，此類細菌拮抗菌同樣通過產生代謝物、揮發性化合物及誘導產生防御相關酶等方式對果蔬病原菌產生了明顯的抑制作用，在果蔬的生物防治中也有較好的開發應用潛力。

此外，乳酸菌是一種在肉、奶、蔬菜和魚的天然微生物群中發現的細菌，它在食品中安全使用已有很長的歷史，被美國食品和藥物管理局公認為是安全的（GRAS）。Fang 等[68]研究保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）F17 對葡萄灰霉病有良好的抑制作用，可能與這兩種乳酸菌產生的低分子量化合物（有機酸、過氧化氫、胞外多糖、細菌素等）有關，同時菌株有良好的抗氧化能力，抑制了葡萄氧化酶的活性，使莖褐變減少，延緩了葡萄的成熟和衰老；Khodaei[69]研究以羧甲基纖維素（CMC）為載體的可食性涂膜通過添加不同量的植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）檢測對新鮮草莓的保鮮效果，發現負載植物乳桿菌的草莓減少了表面酵母和霉菌的生長；同樣，植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）LH-B02[70]懸浮液（1.44×1011CFU·L?1）噴灑在蓮藕表面，不僅色澤損失明顯降低，15 d 貯藏期蓮藕的硬度、咀嚼性、彈性和粘結性等質地特性顯著提高，表明乳酸菌可以改善蓮藕的貯藏性能；彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）與2% 瓜爾豆膠處理的番石榴在抗氧化劑含量（6.68 mg TE·g?1）、抗壞血酸含量（125.40 mg·100 g?1）均高于對照組（5.91 mg TE·g?1）、（101.59 mg·100 g?1），延長了番石榴的貯藏期[71]。在此看來關于乳桿菌的拮抗研究已和相關載體聯合使用均在不同程度上提升果蔬的抗氧化能力，起到了良好的保鮮果蔬的作用。表1 列出了部分具有代表性的細菌拮抗菌株在果蔬上的防控病害研究情況。

表1 部分具有代表性的細菌拮抗菌在果蔬上的防控病害研究情況Table 1 Partially representative bacterial antagonists used for management of postharvest diseases on fruits and vegetables

3.2 真菌

拮抗酵母是一類使用較為廣泛的生防真菌，具有快速繁殖和較強的適應性等優點，成為了水果保鮮研究的焦點之一，季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）[72?74]、檸檬形克勒克酵母（Kloeckera apiculata）[54,75]、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）[76?79]、梅奇酵母（Metschnikowia）[80?81]、膜醭畢赤酵母（Pichia membranaefaciens）[82?83]、出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）[84?85]等均有較多的報道，拮抗酵母的主要優勢是在植株或果實上定殖快，形成生長優勢，產生的胞外多糖提高了它們的生存能力，并阻斷了病原體的繁殖；產生的次級代謝物更具有生態優勢，且其能聯合其他抗菌劑使用等，這些特征均使酵母起到良好的拮抗效果[6]。部分木霉屬也可用作生防微生物，其生物防治活性是由于其競爭營養物質、分泌抗真菌化合物、寄生和激活寄主果實的系統抗性等，目前已報道的果蔬拮抗木霉有：綠色木霉（Trichoderma virens）[21,86?87]、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）[32,88?91]、深綠木霉（Trichoderma atroviride）[92?93]、棘孢木霉（Trichoderma asperellum）[21,94?95]、鉤狀木霉（Trichoderma hamatum）[21,96]等，以及一些突變株，如通過γ射線誘變[97]或基因改造[98]的哈茨木霉（Trichoderma harzianum），其幾丁質酶酶活性顯著提高，增強了木霉對病原菌的生防效果。表2 列出了部分具有代表性的真菌拮抗菌株在果蔬上的防控病害研究情況。

表2 部分具有代表性的真菌拮抗菌在果蔬上的防控病害研究情況Table 2 Partially representative fungal antagonists used for management of postharvest diseases on fruits and vegetables

3.3 放線菌

鏈霉菌屬種眾多且常產生各種抗生素，如多抗霉素、四環霉素、雷弗霉素A 等而被廣泛利用。已有研究表明，鏈霉菌屬（Streptomycessp.）對黃瓜枯萎病菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum）具極強抗性，抑菌率達82.50%[99]；對葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、西瓜枯萎病菌（Fusarrium oxysporumf.sp.niveum）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）、萵苣菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）等均有較強的抑制作用[100]，抑菌率分別為94.55%、63.17%、83.58%、76.66%。淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）Xjy[101]在蘋果果實中的保鮮應用實驗中顯示其阻礙了輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）壞死病灶的擴展；球孢鏈霉菌（Streptomyces globisporus）JK-1[102]對柑橘的青霉病菌（Penicillium italicum）有良好抑制作用，主要是產生的揮發性物質具有抗真菌活性，其中苯乙酮體外抑菌效果最佳。鏈霉菌屬具有的抗真菌作用也體現在產生代謝物抑制菌絲生長，如紫色鏈霉菌（Streptomyces violaceusniger）AC12AB[103]產生的阿扎霉素RS-22A 顯著降低了馬鈴薯瘡痂病發生率達90%；灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus）H7602[104]分泌的1-吡咯-2-羧酸（PCA）對辣椒疫霉（P.capsici）有明顯的拮抗作用；淺紫鏈霉菌（Streptomyces violascens）MT7[105]產生的胞外代謝物對柑橘、番木瓜等多種采后病原真菌具有廣譜抗菌活性。表3 列出了部分具有代表性的放線菌拮抗菌株在果蔬上的防控病害研究情況。

表3 部分具有代表性的放線菌拮抗菌在果蔬上的防控病害研究情況Table 3 Partially representative antagonistic actinomycetes used for management of postharvest diseases on fruits and vegetables

由以上統計可看出，細菌、真菌和放線菌的拮抗菌研究已廣泛在各類果蔬上有所成效，大部分拮抗菌通過代謝物的分泌抑制致病菌的生長，有些拮抗菌對一種或多種致病菌有良好的拮抗作用，因此，在果蔬保鮮上拮抗菌的生物防治有較為廣闊的開發潛力。

4 展望

自然界中微生物資源豐富，在果蔬采后病害控制過程中，拮抗菌做生物防治是目前最有應用前景的，但現研究篩選出應用于果蔬保鮮中的拮抗菌并不多，更多的拮抗菌種類及使用方式尚待人類去開發和利用。現研究的拮抗菌的主要作用機制是通過果蔬的寄生，營養競爭，誘導系統抗性，生產抗生素、水解酶、毒素、揮發性化合物及形成生物膜等多種機制防御病原，研究的種類從原核微生物到真核微生物，均有不同程度地對常見果蔬起到良好的拮抗作用，在實驗室體外研究到拮抗菌的應用保鮮檢測，都有一定程度地改善果蔬存儲效果。但目前拮抗菌生物防治劑多處于研發階段，成果轉化和應用率仍然較低[107]，一方面拮抗菌的有效保鮮成分的提取和純化都不夠精細，且其抵御病原機制往往為多機制作用效果，以單一拮抗機制的抑制效果相對不高；另一方面微生物拮抗菌受果蔬基體環境如溫度、水分、酶活及其他成分的影響，其在果蔬保鮮應用中抑菌活性不太穩定。另外在大多數情況下，生物防治系統存在著與商業條件下的性能差異，在于對拮抗菌作用機制的了解不夠透徹，在基因和生理上操縱相關拮抗劑的激發子或效應子的信息仍然缺乏等。因此盡管拮抗菌能夠控制采后果蔬的腐壞，但僅使用拮抗菌通常不足以達到持續的高腐壞（>95%）的疾病控制[6]，拮抗菌單獨使用和單獨的物理或化學試劑在果蔬采后的保鮮使用效果往往不盡如意，也限制了拮抗菌的使用，如今在研究拮抗菌應用的有效方法之一是將拮抗菌聯合或與一些物理條件或化學試劑配合的情況下，增強果蔬的生防效果。如物理聯合拮抗，熱空氣和拮抗酵母菌（Pichia guilliermondii）聯合處理能有效地抑制蘋果采后灰霉病[108]、桃子采后青霉（Penicillium expansum）和匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）引起的病害[72]，提高了果實的抗氧化酶活性和總酚含量，保持采后的鮮度。化學方法聯合拮抗，1.5% w/v的磷脂酰膽堿能顯著改善葡萄有孢漢遜酵母（Hansenias-pora uvarum）Y3 族群動態，抑制柑桔傷口綠霉病菌的孢子萌發和菌絲生長，且不損害柑桔采后品質[109]；洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）B23 以殼聚糖（0.75%）和氯化鈣（3%）為增效劑，對番木瓜炭疽病的防治效果最佳且不影響果實的品質[110]；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）A7+百里香油（100 μL·L?1）對草莓果實灰霉病（Botrytisspp.）的防治效果顯著[111]。菌體復合聯用拮抗，漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）Y-1 與萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）TE-7 復合使用使芒果氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶、β-1,3-葡聚糖活力增強，顯著提高采后芒果的貯藏品質，增強果實的抗病性[112]；漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）和寡養假單胞菌（Stenophomonas rhizophila）混合培養對甜瓜果實的增殖鐮刀菌（Fusarium proliferatum）的發生率和病斑直徑有顯著抑制作用，與拮抗菌營養競爭、產生的水解酶及次級代謝物有關[113]。因此在拮抗菌單獨使用的局限性情況下，考慮復合應用起到一定的互補或協同效應,從而提高了生物防治方法的整體性能和療效。

如今，也有一些研究者從基因水平開發拮抗菌的拮抗效力，如控制果蔬成熟的某些化合物（乙烯）的生物合成，即影響該化合物合成的關鍵基因的表達[114]，延緩果實成熟，延長保鮮期；或從病原菌出發，通過同源重組蛋白功能性滅活，使基因表達譜發生改變[115]，影響與細胞壁降解酶活性、糖類和氨基酸代謝、分生孢子形成和多種代謝過程相關的基因的表達，從而使病原菌不能誘導果蔬發病腐爛等。特別是近年來分子技術的應用取得了顯著進展，有助于開發創新工具，包括基因組學、宏基因組學、比較基因組學、功能基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學，以剖析拮抗劑、病原體、果蔬寄主、自然微生物區系和環境條件之間的復雜相互作用。如從基因分子水平上研究，一方面通過克隆拮抗菌中相關拮抗蛋白基因，其產物作用于果蔬植株以激活或增加植株的相關防御基因表達，提高植株的抵御病害的能力；另一方面從水果和蔬菜中的生物活性物質出發，通過果蔬采后儲藏處理技術可以減少活性物質的降解或者促進其積累[116]，不少研究者通過轉錄組學、代謝組學分析，快速鑒定地方品種或野生品種的關鍵基因或基因簇，甚至建立“基因庫”[117]，提高果蔬生物活性物質的含量，包括多酚、類胡蘿卜素、維生素等，對產品質量的改善和采前采后的管理非常有用。這或將為未來新型保鮮劑的開發提供思路。

總體來說，采后生物拮抗劑的商業應用非常有限，只占潛在市場的很小一部分。但對化學殺菌劑替代品的需求仍然存在，微生物拮抗產品的前景仍然很有希望。復雜的作用方式使得拮抗性能和功效更依賴于生產、配方、包裝、應用和儲存。利用先進技術可以確定在批量生產、配方和貯藏期間生物防治基因表達水平的變化、微生物生物防治劑的生理狀態以及各種環境脅迫對其胞內機制的影響等，都有可能提高研究者對果蔬采后病原體的微生物控制的理解和認識，隨著科技發展，先進的設備和技術將為微生物拮抗劑的研發帶來機遇。我國拮抗菌保鮮技術的開發和應用仍然任重道遠，更深層次地挖掘和發展高效用、高安全及生態友好的應用于果蔬保鮮的生物農藥，將是未來研究的一個重要方向，且在采后生物防治系統、大規模繁殖和商業規模配制微生物拮抗劑方法的研發也是拮抗菌研究領域的一項重大挑戰。