銀杏葉提取物對(duì)急性腦梗死模型大鼠血腦屏障功能及PI3K/AKT信號(hào)通路的影響及作用機(jī)制

謝濤波 鐘純正 符堯天 王國(guó)卿 米東華

(1儋州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南 儋州 571799；2儋州市農(nóng)墾醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3儋州市人民醫(yī)院精神病科；4首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)重癥醫(yī)學(xué)科)

急性腦梗死又稱(chēng)為缺血性腦卒中，是老年人及三高人群致殘、致死的主要原因，不僅嚴(yán)重影響患者的身心健康，還給患者家庭及社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)〔1〕。腦動(dòng)脈狹窄或堵塞會(huì)引起局部血流減少或中斷，導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧而出現(xiàn)壞死，由于腦組織的耗氧量遠(yuǎn)高于其他組織，對(duì)于缺血缺氧特別敏感，腦功能也是最早受損〔2〕。盡管急性腦梗死的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但血腦屏障的破壞是腦梗死后腦水腫發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)〔3〕。

目前，臨床腦缺血類(lèi)疾病的治療效果仍不理想，尋求新的治療方法和策略迫在眉睫。銀杏葉提取物是提取自銀杏葉的活性成分，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、抗凋亡等生理功效〔4〕。Liu等〔5〕報(bào)道，銀杏葉提取物結(jié)合雙嘧達(dá)莫注射液可輔助治療急性腦梗死。Wu等〔6〕研究指出，銀杏葉提取物可降低急性腦梗死大鼠腦組織細(xì)胞的凋亡，而起到保護(hù)保組織的作用。但銀杏葉提取物對(duì)急性腦梗死后血腦屏障的破壞是否有保護(hù)作用，未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本研究構(gòu)建急性腦梗死大鼠模型，觀(guān)察銀杏葉提取物對(duì)模型大鼠血腦屏障功能的影響及作用機(jī)制，旨在為銀杏葉提取物的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 60只雄性、健康級(jí)SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2019-0010；銀杏葉提取物(德國(guó)威瑪舒，注冊(cè)證號(hào)H20170088，規(guī)格：40 mg×20片)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液、TUNEL染色試劑盒(武漢博士德生物公司)，蛋白一抗(美國(guó)Abcam)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的蛋白二抗、電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑(上海碧云天生物科技有限公司)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海朕碩生物科技有限公司)。

1.2急性腦梗死模型的構(gòu)建 大鼠禁食12 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，于頸部正中切口，暴露頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，于頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈交叉處剪一小口，插入肝素預(yù)處理尼龍線(xiàn)結(jié)扎，阻斷動(dòng)脈血液流動(dòng)，消毒后逐層縫合，術(shù)后注意抗感染處理和保暖。當(dāng)大鼠出現(xiàn)左側(cè)肢疼痛回縮遲鈍或消失、倒懸時(shí)左上肢向胸前屈曲、行走時(shí)身體向左側(cè)傾倒或向左轉(zhuǎn)圈等表現(xiàn)時(shí)，神經(jīng)損傷評(píng)分≥2分可判斷急性腦梗死大鼠模型復(fù)制成功〔7〕。

1.3分組與處理 取60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、銀杏葉提取物組(低劑量組和高劑量組)，除假手術(shù)組外，其他組采用中動(dòng)脈閉塞法復(fù)制急性腦梗死模型，假手術(shù)組僅鈍性分離肌肉和血管，但不夾閉血管。銀杏葉提取物組術(shù)后灌胃50 mg/kg、100 mg/kg的銀杏葉提取物，1次/d，連續(xù)灌胃7 d，假手術(shù)組和模型組以等體積生理鹽水替代。

1.4伊文思藍(lán)檢測(cè)血腦屏障通透性 給藥結(jié)束后，尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)，24 h后麻醉大鼠，打開(kāi)胸腔暴露心臟，將針尖沿心軸方向插入左心室，可見(jiàn)血液回流時(shí)夾閉針尖破口，再剪開(kāi)右心耳，用生理鹽水(約10 ml)進(jìn)行心臟灌流，當(dāng)右心耳流出液體澄清時(shí)，取出腦組織稱(chēng)重，以1.5 ml/g腦組織制備腦組織勻漿(50%三氯乙酸溶液)，3 000 r/m離心20 min后，于620 nm處檢測(cè)吸光度值。

1.5大鼠神經(jīng)功能評(píng)價(jià) 記錄大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀，參照Longa標(biāo)準(zhǔn)〔8〕進(jìn)行評(píng)定，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀為0分，提尾時(shí)病灶對(duì)側(cè)前肢不能完全伸直為1分，提尾時(shí)病灶對(duì)側(cè)前肢屈曲為2分，行走時(shí)輕度向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈為3分，行走時(shí)嚴(yán)重向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈為4分，不能自發(fā)行走且向?qū)?cè)跌倒為5分。

1.6腦組織含水量的測(cè)定 處理結(jié)束后，斷頭取出腦組織稱(chēng)重(濕重)，置于120℃烤箱內(nèi)，烘干后取出再次稱(chēng)重(干重)，腦組織含水量=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%。

1.7TTC染色法測(cè)定腦組織梗死體積 處理結(jié)束后，斷頭取出腦組織，制備為厚度2 mm的腦片，置于2% TTC溶液中，37℃下染色7 min，再將腦片固定于4%多聚甲醛中，拍照后經(jīng)圖像分析軟件測(cè)定腦梗死面積，腦梗死體積=〔總梗死體積-(梗死側(cè)半球體積-梗死對(duì)側(cè)半球體積)〕/梗死對(duì)側(cè)半球體積×100%。

1.8TUNEL染色檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡 處理結(jié)束后，斷頭取出腦組織，制備為厚度8 μm石蠟切片，水化處理后滴加不含DNA酶的蛋白酶K，室溫下反應(yīng)30 min，再添加3%過(guò)氧化氫溶液，室溫下反應(yīng)10 min，接著添加50 μl生物素標(biāo)記物，37℃下反應(yīng)60 min，再滴加100 μl終止液，室溫下反應(yīng)10 min，然后添加50 μl Streptavidin-HRP工作液，室溫下反應(yīng)30 min，最后進(jìn)行二胺基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木素復(fù)染，經(jīng)脫水、透明后封片。

1.9蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 處理結(jié)束后，斷頭取出腦組織，加入組織裂解液，冰上勻漿，充分裂解1 h，經(jīng)12 000 r/m離心10 min，分離上清液檢測(cè)蛋白濃度，取50 μg蛋白用于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白條帶完全分離后電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，再將蛋白膜置于5%脫脂奶粉中，室溫下孵育1 h，依次置于蛋白一抗(1∶1 000，4℃過(guò)夜)、HRP標(biāo)記的蛋白二抗(1∶5 000，37℃ 40 min)中，最后添加ECL發(fā)光劑進(jìn)行顯影，Image J軟件檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

1.10ELISA檢測(cè)炎癥因子含量 處理結(jié)束后，斷頭取出腦組織，應(yīng)用生理鹽水制備10%腦組織勻漿液，3 500 r/m離心15 min，取上層血清，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)腦組織勻漿液中白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β及腫瘤壞死因子(TNF)-α的含量。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠神經(jīng)功能缺失、腦水腫及腦梗死情況 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)損傷評(píng)分、腦組織含水量及腦梗死體積明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉提取物低、高劑量組神經(jīng)損傷評(píng)分、腦梗死體積、銀杏葉提取物及高劑量組腦組織金水量明顯降低，且高劑量組腦梗死體積改善顯著優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2大鼠血腦屏障的通透性 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織伊文思藍(lán)含量明顯增加，腦組織中緊密連接蛋白(Claudin-5)和Occludin表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉提取物高劑量組伊文思藍(lán)含量明顯降低，Claudin-5和Occludin表達(dá)明顯增加，高劑量組Clandin-5改善顯著優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組神經(jīng)功能缺失、腦水腫及腦梗死情況及血腦屏障通透性

1～4：假手術(shù)組，模型組，銀杏葉提取物低劑量組，銀杏葉提取物高劑量組；圖3、4同圖1 大鼠腦組織中緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.3大鼠腦組織細(xì)胞的凋亡 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率、腦組織中切割后半胱氨酸天冬氨酸酶(cleaved caspase)-3和cleaved caspase-9表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉提取物組凋亡率、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9表達(dá)降低，除低劑量組凋亡率外，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2、圖3、表2。

圖2 各組腦組織細(xì)胞的凋亡情況(TUNEL，×200)

圖3 各組腦組織中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.4大鼠腦組織勻漿液中炎癥因子水平 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織勻漿液中IL-6、IL-1β及TNF-α含量明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉提取物組IL-6、IL-1β及TNF-α含量明顯降低，高劑量組TNF-α改善顯著優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.5大鼠腦組織磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中磷酸化(p)-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉提取物高劑量組p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT水平明顯增加，高劑量組p-Akt/Akt改善顯著優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖4。

表2 各組腦組織細(xì)胞凋亡、炎癥因子水平及PI3K/Akt磷酸化水平比較(ng/L，n=15)

圖4 大鼠腦組織中PI3K/AKT的表達(dá)

3 討 論

腦水腫是急性腦梗死患者病情惡化和死亡的常見(jiàn)原因，局部缺血缺氧后，腦組織內(nèi)鈉-鉀離子代謝失衡，細(xì)胞間水分將進(jìn)入胞內(nèi)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性水腫。相較于細(xì)胞毒性水腫，血管性水腫與血腦屏障的密切相關(guān)。腦梗死后腦組織中炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等病理?yè)p傷過(guò)程，可破壞血腦屏障，進(jìn)一步加重腦損傷，形成惡性循環(huán)，擴(kuò)大腦內(nèi)組織損傷范圍。因此，減輕繼發(fā)性腦損傷和保護(hù)血腦屏障是急性腦梗死的重要治療策略。

本研究結(jié)果顯示，銀杏葉提取物可有效降低模型大鼠神經(jīng)損傷評(píng)分、腦梗死體積，提示銀杏葉提取物對(duì)于急性腦梗死有保護(hù)作用，與既往研究結(jié)果相符〔9〕。血腦屏障是血液和腦組織之間的保護(hù)性生物膜系統(tǒng)，可有效組織一些異物和大分子進(jìn)入腦組織，主要由腦的毛細(xì)血管壁和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成，其中緊密連接蛋白對(duì)維持血腦屏障的完整性至關(guān)重要。本研究中，銀杏葉提取物處理后，大鼠腦組織含水量降低，腦組織中伊文思藍(lán)的滲透量減少，緊密連接蛋白主要成分Claudin-5、Occludin表達(dá)增加，提示銀杏葉提取物可能通過(guò)增加緊密連接蛋白表達(dá)，保護(hù)血腦屏障。

腦組織供血血管出現(xiàn)急性閉塞后，缺血區(qū)會(huì)爆發(fā)強(qiáng)效、持久的炎癥反應(yīng)，分泌及釋放IL-6、IL-1β、TNF-α、趨化因子及黏附分子等多種炎性因子，誘使周?chē)?xì)胞的死亡，破壞血腦屏障，進(jìn)一步擴(kuò)大病變區(qū)域。因此，積極控制急性腦梗死患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)水平，不僅可以防止腦損傷進(jìn)展，還可減輕血腦屏障損傷。本研究結(jié)果顯示，銀杏葉提取物處理后，急性腦梗死大鼠腦組織勻漿液中IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低，這與Gargouri等〔10〕研究報(bào)道銀杏葉提取物的抗炎活性相符。

PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也廣泛存在于各類(lèi)神經(jīng)細(xì)胞中，對(duì)于細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡等生物學(xué)過(guò)程具有調(diào)節(jié)作用。Xiong等〔11〕研究指出，沉默血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)后可通過(guò)抑制PI3K/AKT通路，誘導(dǎo)新生兒缺氧缺血后神經(jīng)元凋亡。Chang等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，小RNA634可通過(guò)PI3K/AKT通路，抑制腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。Cao等〔13〕研究顯示，銀杏葉提取物可介導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。TUNEL染色和蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，銀杏葉提取物可降低模型大鼠腦組織細(xì)胞的凋亡，減少腦組織中凋亡關(guān)鍵蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達(dá)，并提高PI3K和AKT的磷酸化水平，提示銀杏葉提取物可能通過(guò)促進(jìn)PI3K/AKT信號(hào)通路的活化，抑制急性腦梗死大鼠腦組織細(xì)胞的凋亡。

綜上，銀杏葉提取物可改善急性腦梗死模型大鼠神經(jīng)功能，保護(hù)血腦屏障功能，可能與抑制腦組織細(xì)胞凋亡、減輕腦內(nèi)炎癥反應(yīng)、活化PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。但銀杏葉提取物用于急性腦梗死的治療，仍需要更多的證據(jù)支持。