miR-365-3p靶向PTEN調控骨關節軟骨細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲

安貴峰 曾艷 陳擁

(沈陽醫學院附屬中心醫院骨外科，遼寧 沈陽 110024)

骨關節炎是一類關節邊緣骨骼變化、軟骨發生纖維化、潰瘍及脫落等現象的關節疾病，多發于中老年人群，并且女性多于男性，嚴重影響患者生活質量〔1〕。骨關節炎的發病機制較為復雜，認為其發病原因與軟骨細胞在細胞外基質中的異常增殖、遷移等導致的關節軟骨愈合、修復能力異常密切相關〔2〕。微小RNA(miRNA)是一類小分子單鏈非編碼RNA，其可通過靶向靶基因的表達參與調控細胞增殖、分化和凋亡等生物學行為〔3〕。研究顯示，miRNA參與骨關節炎的發生和發展〔4〕。有報道稱，miR-365在膝骨關節炎患者血漿和關節滑液中表達上調，可能參與了膝骨關節炎的病理過程〔5〕；miR-365在原發性骨關節炎患者和創傷性骨關節炎患者軟骨中表達升高，抑制miR-365表達能夠下調白細胞介素(IL)-1β誘導的基質金屬蛋白酶(MMP)-13和X型膠原(Col X)的基因表達，miR-365可能是預防和治療骨關節炎的潛在靶點〔6〕。本研究主要探討miR-365對骨關節軟骨細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1組織樣本來源 選取2017年10月至2018年12月沈陽醫學院附屬中心醫院關節與骨髓腫瘤病區接受治療的60例骨關節炎患者作為骨關節炎組。診斷標準參照2007年中華醫學會骨科學分會《骨關節炎診治指南》〔7〕。其中男19例，女41例，年齡62～75〔平均(69.23±5.21)〕歲。另選取60例因股骨頸骨折而行全髖關節置換術的患者作為正常對照組，其中男22例，女38例，年齡60～76〔平均(68.59±5.67)〕歲。兩組年齡、性別等差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。兩組關節軟骨標本在游離后無菌狀態下置于裝有平衡液的無菌標準袋，送往實驗室處理。

1.2實驗試劑 miRNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(Takara公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；DMEM培養基、四甲基偶氮唑藍(MTT)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒、Annexin V-FITC/PI試劑盒(北京索萊寶)；LipofectamineTM2000試劑盒(美國 Invitrogen公司)；miR-365-3p模擬物(mimics)和抑制劑(anti-miR-365-3p)、模擬對照(miR-NC)和抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)過表達載體(pcDNA3.1-PTEN)及空載體(pcDNA3.1)(上海生工)；Western印跡實驗相關抗體(武漢博士德公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega公司)。

1.3方法

1.3.1qRT-PCR檢測miR-365-3p表達 使用miRNA提取試劑盒提取軟骨組織中總RNA，逆轉錄為cDNA后，行PCR擴增。PCR擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環。 2-△△Ct法計算miR-365-3p相對U6的表達量。

1.3.2原代人骨關節軟骨細胞分離和培養 參照文獻方法分離培養人骨關節軟骨細胞〔8〕。將手術取下的軟骨標本用生理鹽水沖洗，去除殘留的血液和組織液，于1 h內無菌轉移至超凈工作臺內，使用含1%雙抗(青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml)并預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次。用手術刀片薄層削取關節中心區域的軟骨薄片，用預冷PBS清洗3次，并將其切成約1 mm3碎塊。PBS清洗3次后，加入0.25%胰蛋白酶消化液，37℃培養箱中消化30 min。吸棄消化液，加入0.2%Ⅱ型膠原酶消化16 h。1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入DMEM培養基再次洗滌細胞。1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，200目濾網過濾后，將細胞以1×105/ml密度接種于細胞培養瓶中，置于CO2培養箱中培養。

1.3.3細胞轉染 將對數期軟骨細胞以5.0×105個/孔接種于6孔板中，培養24 h后，棄培養基，用LipofectamineTM2000試劑盒分別轉染miR-365-3p mimics(miR-365-3p組)、miR-NC(miR-NC組)、anti-miR-365-3p(anti-miR-365-3p組)、anti-miR-NC(anti-miR-NC組)、共轉染miR-365-3p與pcDNA3.1(miR-365-3p+pcDNA3.1組)、miR-365-3p與pcDNA3.1-PTEN(miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN組)。轉染12 h后，更換為新鮮培養基。再培養24 h，檢測細胞中miR-365-3p或PTEN表達驗證轉染效果，并收集細胞用于后續實驗。

1.3.4MTT檢測細胞增殖 將miR-365-3p組、miR-NC組、miR-365-3p+pcDNA3.1組和miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN組細胞以2.5×104個/孔接種于96孔板中，培養24 h后，加20 μl MTT。孵育4 h后，棄上清液。加150 μl二甲基亞砜，室溫孵育5 min后，震蕩混勻，于酶標儀490 nm測吸光度(A)值。增殖抑制率(%)=(A對照組-A實驗組)/A對照組×100%。

1.3.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 將miR-365-3p組、miR-NC組、miR-365-3p+pcDNA3.1組和miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN組細胞以1.0×105個/孔細胞接種于24孔板中，培養24 h后，收集細胞，用AnnexinV-FITC/PI試劑盒檢測各組細胞凋亡情況。

1.3.6Transwell檢測細胞遷移和侵襲 遷移實驗：取100 μl miR-365-3p組、miR-NC組、miR-365-3p+pcDNA3.1組和miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN組細胞懸液加至Transwell小室的上室(1.0×104個/室)，500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養基加至下室。培養24 h，無菌棉簽擦去上室未遷移細胞，用4%多聚甲醛固定、結晶紫染色后，顯微鏡下觀察并計數。侵襲實驗：預先將基質膠鋪于Transwell上室，凝固后，再加100 μl細胞懸液，后續操作同遷移實驗。

1.3.7Western印跡檢測蛋白表達 將miR-365-3p組、miR-NC組、miR-365-3p+pcDNA3.1組和miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN組細胞以1.0×105個/孔細胞接種于24孔板中，培養24 h后，收集細胞。RIPA裂解液提取細胞中總蛋白，BCA法定量后，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳。然后將分離蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，于5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h。于4℃冰箱中分別用細胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關x蛋白(Bax)、鈣黏附蛋白-E(E-cadherin)、MMP-2、PTEN和GAPDH一抗孵育過夜。洗膜后，加辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育2 h。加顯影液，避光顯影，曝光拍照后，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3.8雙熒光素酶報告基因實驗 采用PCR技術對含miR-365-3p結合位點的PTEN的3′UTR進行擴增，構建PTEN的3′UTR野生型熒光素酶載體(WT-PTEN)和突變型熒光素酶載體(MUT-PTEN)。將對數期軟骨細胞以每孔5.0×105個/孔接種于6孔板中，培養24 h后，棄培養基，用LipofectamineTM2000試劑盒分別共轉染WT-PTEN與miR-365-3p mimics、WT-PTEN與miR-NC、MUT-PTEN與miR-365-3p mimics、WT-PTEN與miR-NC。轉染12 h后，更換新鮮培養基。再培養24 h，收集細胞并裂解。將裂解液3 500 r/min離心5 min后，取上清檢測熒光素酶活性。

1.4統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1骨關節炎患者軟骨組織中miR-365-3p表達水平 與正常對照組miR-365-5p水平(0.22±0.02)比較，骨關節炎組(0.67±0.07)顯著升高(t=47.880,P=0.000)，表明miR-365-3p在骨關節炎患者軟骨組織中高表達。

2.2過表達miR-365-3p對軟骨細胞增殖、凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-365-3p組軟骨細胞中miR-365-3p表達、細胞增殖抑制率、凋亡率及細胞中p21、Bax蛋白表達均顯著升高(均P<0.05)，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。見圖1、圖2、表1和表2。

表2 過表達miR-365-3p對軟骨細胞凋亡的影響

圖1 過表達miR-365-3p對軟骨細胞增殖、凋亡的影響

圖2 Western印跡增殖、凋亡相關蛋白的表達

表1 過表達miR-365-3p對軟骨細胞增殖的影響

2.3過表達miR-365-3p對軟骨細胞遷移、侵襲的影響 miR-365-3p組遷移細胞數、侵襲細胞數及MMP-2蛋白表達均顯著低于miR-NC組(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達顯著高于miR-NC組(均P<0.05)。見圖3、圖4、表3。

圖3 Western印跡檢測過表達miR-365-3p對軟骨細胞遷移、侵襲蛋白表達的影響

圖4 過表達miR-365-3p對軟骨細胞遷移、侵襲的影響(結晶紫，×200)

表3 過表達miR-365-3p對軟骨細胞遷移、侵襲的影響

2.4miR-365-3p靶向調控PTEN表達 TargetScan生物信息學軟件預測顯示的PTEN的3′UTR與miR-365-3p的結合位點見圖5。共轉染WT-PTEN與miR-365-3p mimics的細胞熒光素酶活性顯著低于共轉染WT-PTEN與miR-NC的細胞熒光素酶活性(P<0.05)，而共轉染MUT-PTEN與miR-365-3p mimics的細胞熒光素酶活性與共轉染MUT-PTEN與miR-NC的細胞熒光素酶活性比較無顯著變化(P>0.05)，見表4。與miR-NC組比較，miR-365-3p組PTEN mRNA與蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-365-3p組PTEN mRNA與蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見圖6、表5。

圖5 PTEN的3′UTR含有miR-365-3p的互補序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

1～4:miR-NC組、miR-365-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-365-3p組圖6 Western印跡檢測PTEN表達的影響

表5 miR-365-3p調控PTEN的表達

2.5過表達PTEN能逆轉過表達miR-365-3p對軟骨細胞增殖、凋亡的影響 miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN組軟骨細胞增殖抑制率、凋亡率及p21和Bax蛋白表達均顯著低于miR-365-3p+pcDNA3.1組(P<0.05)，PTEN、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達均顯著高于miR-365-3p+pcDNA3.1組(P<0.05)。見表6、表7、圖7。

表6 過表達PTEN能逆轉過表達miR-365-3p對軟骨細胞增殖的影響

表7 過表達PTEN能逆轉過表達miR-365-3p對軟骨細胞凋亡的影響

1～2：miR-365-3p+pcDN-3.1組、miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN組，下圖同圖7 過表達PTEN 能逆轉過表達miR-365-3p對軟骨細胞增殖凋亡蛋白表達的影響

2.6過表達PTEN逆轉過表達miR-365-3p對軟骨細胞遷移、侵襲的影響 miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN組遷移細胞數、侵襲細胞數及MMP-2蛋白表達均顯著高于miR-365-3p+pcDNA3.1組(P<0.05)，而E-cadherin蛋白表達顯著低于miR-365-3p+pcDNA3.1組。見表7、圖8。

1～2：miR-365-3p+pcDN-3.1、miR-365-3p+pcDNA3.1-PTEN圖8 過表達PTEN逆轉過表達miR-365-3p對軟骨細胞遷移侵襲蛋白表達的影響

3 討 論

骨關節炎是一種退行性疾病，在老年人群中具有較高的發病率〔9〕。正常的關節軟骨主要由軟骨細胞和細胞外基質組成，軟骨細胞在維持軟骨完整性、關節軟骨的負重功能及軟骨損傷和重塑等方面發揮重要作用〔10〕。軟骨細胞生物學行為的異常是骨關節炎進展的重要原因之一〔11〕。研究表明，miRNA參與調控骨關節炎的發生進程〔12〕。miR-193b-3p靶向組蛋白去乙酰化酶3調節人軟骨細胞間充質干細胞的軟骨形成和代謝〔13〕；miRNA-130a在骨關節炎患者血清中表達水平降低，下調miRNA-130a表達可能通過抑制PTEN/PI3K/Akt信號通路抑制軟骨細胞增殖，并誘導軟骨細胞凋亡〔14〕；miR-222在骨關節炎軟骨細胞中表達下調，過表達miR-222通過下調HDAC-4和MMP-13水平抑制軟骨細胞的凋亡〔15〕。提示miR-365-3p有可能成為骨關節炎治療的分子靶點。

PTEN是目前發現的具有磷酸酶活性的抑癌基因，其與骨關節炎的發生發展也密切相關。研究表明，敲除小鼠關節軟骨細胞中的PTEN/PI3K/Akt信號通路過度持續激活，進而導致骨關節炎的發生〔16〕；PTEN在類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞中表達下調，參與類風濕關節炎的發生和發展〔17〕；過表達miR-181通過靶向調控PTEN表達抑制軟骨細胞增殖，并促進軟骨細胞凋亡〔18〕。提示miR-365-3p可能通過抑制PTEN來阻礙軟骨細胞增殖、遷移和侵襲，并促進其凋亡。

綜上，miR-365-3p在骨關節炎軟骨組織中表達上調，過表達miR-365-3p對骨關節炎軟骨細胞增殖、遷移和侵襲發揮抑制作用，而對細胞凋亡起促進作用，其作用機制可能與靶向抑制PTEN表達有關，miR-365-3p/PTEN軸可能為骨關節炎的治療提供了的潛在靶點。