不同喂養方式的足月兒3月齡時免疫功能特點分析的前瞻性隊列研究

馬菁苒 李正紅 張文娟 張春麗 張鈺恒 梅花 卓娜 王紅云 吳丹

（1.中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院兒科/疑難重癥及罕見病國家重點實驗室，北京 100730；2.內蒙古自治區人民醫院新生兒科，內蒙古呼和浩特 010010；3.內蒙古醫科大學附屬醫院新生兒科，內蒙古呼和浩特 010050；4.內蒙古婦幼保健院新生兒科，內蒙古呼和浩特 010020）

母乳喂養可以降低嬰幼兒患感染性疾病的風險，這與母乳中的很多活性成分有關，這些成分參與嬰幼兒的體液免疫反應及細胞免疫反應，也可促進嬰幼兒器官功能成熟。目前關于喂養方式與嬰兒自身免疫功能關系的研究逐步開展，本研究檢測了不同喂養方式在3月齡健康足月嬰兒中，包括外周血淋巴細胞亞群在內的免疫功能特點，并分析其與喂養方式、性別的關系。

此外，嬰兒的免疫系統處在較快發育過程中，但嬰兒免疫功能檢測受到參考值不規范的制約，開展較少。有文獻報道兒童淋巴細胞亞群的參考值，但因兒童淋巴細胞亞群隨年齡而變化，文獻中3月齡及以下嬰兒樣本量少，無法在嬰兒中按月齡區分參考值；另外，淋巴細胞亞群可能受到種族、地理位置、性別、環境因素等影響，導致參考值存在一定差異［1］，使國外研究數據在中國人中的應用價值受到影響。本研究探討了中國3月齡足月嬰兒免疫功能指標的參考值，為評估健康嬰兒免疫功能提供參考數據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究為前瞻性隊列研究，研究對象來自北京及呼和浩特共4家醫院（華北新生兒聯盟成員單位），包括北京協和醫院、內蒙古自治區人民醫院、內蒙古醫科大學附屬醫院、內蒙古婦幼保健院。本研究經過北京協和醫院倫理委員會審批（ZS-1148）。

納入標準：（1）2016年12月至2017年12月期間出生。（2）出生胎齡≥37周。（3）出生體重≥2.5 kg。（4）家長自愿加入研究，并簽署知情同意書。

排除標準：（1）出生胎齡<37周。（2）出生體重<2.5 kg。（3）患兒存在嚴重慢性疾病，如心力衰竭、遺傳代謝性疾病或先天性消化道畸形等。（4）患兒在隨訪期間出現原發性免疫缺陷病（primary immunodeficiency disorder，PID）可疑表現者［2］。

根據家長所選擇的喂養方式分為母乳喂養組和奶粉喂養組。將生后4個月內純母乳喂養兒納入母乳喂養組，在生后40 d常規隨診時入組。將由于母親疾病或用藥而不能母乳喂養者納入奶粉喂養組，生后即入組；喂養奶粉為在本研究所免費提供奶粉中自選種類，均為上市銷售的產品，生后4個月內使用同一奶粉品牌純奶粉喂養。兩組嬰兒在生后4個月內均為純母乳喂養或純奶粉喂養，均未添加輔食。

退出標準：（1）喂養方式在4個月內發生改變者；（2）家長因任何原因要求退出研究者。

1.2 研究方法

兩組嬰兒于生后3月齡時采集外周靜脈血標本5 mL，檢測細胞免疫（淋巴細胞亞群）、體液免疫（包括IgG、IgA、IgM）功能，以及血常規。比較上述指標在不同喂養方式和性別的嬰兒中有無顯著性差異。

外周血淋巴細胞亞群檢測：所檢測淋巴細胞亞群包括B細胞（CD3-CD19+）、NK細胞（CD3-CD 56+CD16+）、CD4+T細胞（CD3+CD4+）、CD8+T細胞（CD3+CD8+）、CD4+T和CD8+T細胞的第二信號受體CD28表達比例（CD4+CD28+/CD4+、CD8+CD28+/CD8+）、CD8+T細胞的HLA-DR、CD38表達比例（CD8+DR+/CD8+、CD8+CD38+/CD8+）、Naive細胞比例（CD4+CD45RA+/CD4+）、記憶T4細胞比例（CD4+CD45RA-/CD4+）。具體檢測方法參照文獻［3］。細胞計數和比例采用中位數表示，計數單位為個/μL。

1.3 統計學分析

使用SPSS 22.0統計軟件對數據進行統計學分析。正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗；非正態分布計量資料以中位數（P10，P90）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料采用百分率（%）表示，兩組間比較采用Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基本資料特征

本研究入組91例，中途退出7例，共84例嬰兒納入研究。其中男45例，女39例；出生胎齡（39.3±1.1）周（范圍37～42周），出生體重（3 313±395）g（范圍2 500～4 400 g），出生身長（50.1±1.9）cm（范圍45.0～54.0 cm），出生頭圍（33.7±0.8）cm（范圍32.0～35.0 cm）；母親年齡（31±4）歲（范圍21～42歲）。母乳喂養組26例，奶粉喂養組58例。因嬰兒外周靜脈血采集存在一定技術困難，最終共采得84例有效血常規，82例有效免疫球蛋白檢查；21例行淋巴細胞亞群檢查。其中隨訪60例，隨訪年齡（23.5±3.7）月齡，均無慢性疾病及PID在嬰兒期的可疑表現。表1列出了3月齡嬰兒免疫功能及血常規指標檢測結果，以供臨床參考。

表1 3月齡嬰兒免疫功能及血常規檢測結果［（±s）或中位數（P10，P90）］

表1 3月齡嬰兒免疫功能及血常規檢測結果［（±s）或中位數（P10，P90）］

注：［Ig］免疫球蛋白；［WBC］白細胞；［LY］淋巴細胞；［NEUT］中性粒細胞；［Mono］單核細胞；［EOS］嗜酸性粒細胞；［RBC］紅細胞；［Hb］血紅蛋白；［HCT］紅細胞壓積；［PLT］血小板；［B］B淋巴細胞；［NK］自然殺傷細胞；［T］T淋巴細胞。

實驗室指標IgG(g/L)IgA(g/L)IgM(g/L)WBC計數(×109/L)LY(%)LY計數(×109/L)NEUT(%)NEUT計數(×109/L)Mono(%)EOS(%)RBC計數(×1012/L)Hb(g/L)HCT(%)PLT計數(×109/L)B(%)B計數(個/μL)NK(%)NK計數(個/μL)T(%)T計數(個/μL)CD4+T(%)CD4+T計數(個/μL)CD8+T(%)CD8+T計數(個/μL)CD4+CD28+/CD4+(%)CD4+CD28+/CD4+計數(個/μL)CD8+CD28+/CD8+(%)CD8+CD28+/CD8+計數(個/μL)CD8+DR+/CD8+(%)CD8+DR+/CD8+計數(個/μL)CD8+CD38+/CD8+(%)CD8+CD38+/CD8+計數(個/μL)Naive細胞CD4+CD45RA+/CD4+(%)Naive細胞CD4+CD45RA+/CD4+計數(個/μL)記憶T4細胞CD4+CD45RA-/CD4+(%)記憶T4細胞CD4+CD45RA-/CD4+計數(個/μL)CD4/CD8(%)n 82 82 82 84 83 83 83 83 83 83 84 84 84 84 20 20 21 21 21 21 21 21 21 21 18 18 18 18 18 18 18 18 18數值3.0±1.5 0.16±0.19 0.35(0.21,0.58)8.5±2.8 64±12 5.00(3.05,8.11)24±11 2.1±1.5 6.6±2.2 3.6±2.0 4.1±0.5 117±14 36±5 377±127 23±7 1 070.5(626.4,2 126.1)4.70(2.02,9.36)215.0(82.0,853.2)71±7 3 420.0(2 234.0,5 883.8)50±8 2 251.0(1 628.0,4 334.6)18±5 919±378 99.70(97.96,100.00)2 161.5(1 565.5,4 641.3)93.00(66.86,95.86)819±349 2.90(0.74,27.94)23.0(5.7,343.6)95.2±1.7 891±361 77.60(56.53,86.50)18 1 713.5(934.9,3 228.5)18 22.40(13.50,43.47)478.5(366.2,1 006.5)2.94(1.71,5.46)18 21

2.2 不同喂養方式的嬰兒基本資料及在生后3月齡時的實驗室指標分析

母乳喂養組中，男10例，女16例；出生胎齡（39.6±1.1）周，出生體重（3 340±460）g，出生身長49.0（46.2，52.0）cm，出生頭圍（33.8±1.3）cm；母親年齡30（27，34）歲。資料完整的18例中，母親懷孕前BMI（21.1±4.1）kg/m2，孕期增重（16±7）kg，圍生期有6%（1/18）使用過抗生素；嬰兒3月齡內均未使用抗生素；44%（8/18）的嬰兒有兄弟姐妹，6%（1/18）的嬰兒家庭有寵物，89%（16/18）的嬰兒居住在城市，50%（9/18）的嬰兒為順產。

奶粉喂養組中，男35例，女23例；出生胎齡（39.0±1.1）周，出生體重（3 283±385）g，出生身長50.0（48.0，53.0）cm，出生頭圍（33.6±0.8）cm；母親年齡31（25，39）歲；資料完整的42例中，母親懷孕前BMI（21.3±4.0）kg/m2，孕期增重（13±6）kg，圍生期有17%（7/42）使用過抗生素；嬰兒3月齡內有17%（7/42）使用過抗生素；50%（21/42）的嬰兒有兄弟姐妹，5%（2/42）的嬰兒家庭有寵物，79%（33/42）的嬰兒居住在城市，40%（17/42）的嬰兒為順產。兩組間嬰兒的上述基本情況中，僅母乳喂養組的母親年齡小于奶粉喂養組（Z=-2.001，P=0.045），余資料比較差異均無統計學意義（P>0.05）。

實驗室指標方面，T細胞第二信號受體CD28表達比例（包括CD4+T細胞和CD8+T細胞），在母乳喂養組顯著低于奶粉喂養組（P<0.05）。CD8+T細胞表面激活標記物HLA-DR的計數及比例，在母乳喂養組顯著高于奶粉喂養組（P<0.05）。母乳喂養組免疫球蛋白M、中性粒細胞比例及計數均顯著低于奶粉喂養組，淋巴細胞比例顯著高于奶粉喂養組（P<0.05）。見表2。

表2 不同喂養方式的嬰兒在3月齡時差異有統計學意義的實驗室指標比較 ［中位數（P10，P90）］

2.3 不同性別的嬰兒在生后3月齡的免疫功能及血常規的特點分析

男嬰45例，出生胎齡39+2（37+3，40+3）周，出生體重（3 356±355）g，出生身長（50.3±1.7）cm，出生頭圍（33.6±0.8）cm；母親年齡（31±4）歲，懷孕前BMI（22.1±3.8）kg/m2，孕期增重（14±6）kg。資料完整的32例中，母親圍生期有12%（4/32）使用過抗生素；嬰兒3月齡內有12%（4/32）使用過抗生素；44%（14/32）的嬰兒有兄弟姐妹，3%（1/32）的嬰兒家庭有寵物，91%（29/32）的嬰兒居住在城市，47%（15/32）的嬰兒為順產，22%（10/45）的嬰兒為純母乳喂養。

女嬰39例，出生胎齡39+3（37，40+4）周，出生體重（3 237±457）g，出生身長（49.8±2.2）cm，出生頭圍（33.7±0.8）cm；母親年齡（31±5）歲，懷孕前BMI（20.3±4.0）kg/m2，孕期增重（14±7）kg。資料完整的28例中，母親圍生期有14%（4/28）使用過抗生素；嬰兒3月齡內有11%（3/28）使用過抗生素；54%（15/28）的嬰兒有兄弟姐妹，7%（2/28）的嬰兒家庭有寵物，71%（20/28）的嬰兒居住在城市，39%（11/28）的嬰兒為順產，41%（16/39）的嬰兒為純母乳喂養。按性別分組，比較兩組間嬰兒的上述基本情況，差異均無統計學意義（P>0.05）。

實驗室指標方面，男嬰白細胞計數低于女嬰，嗜酸性粒細胞比例高于女嬰（P<0.05）。余免疫功能及血常規指標在兩組嬰兒3月齡時比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 （續）

表3 男嬰和女嬰在3月齡時免疫功能及血常規指標比較 ［中位數（P10，P90）］

3 討論

嬰兒期免疫功能的監測具有重要意義，可以指導某些疾病如巨細胞病毒感染、先天性免疫缺陷等的篩查及診療。上述疾病逐漸引起人們重視且并不少見。但嬰兒的免疫系統處在較快發育過程中，不同月齡的嬰兒，其免疫功能指標的參考范圍數據來源有限，限制了相關檢測項目的開展。目前關于兒童淋巴細胞亞群的參考值存在一定局限性。首先，兒童細胞亞群隨年齡而變化，既往國內外報道的細胞亞群值均為某一年齡段數據［1，4-8］，國內數據為1～6月齡參考值，其中3月齡及以下嬰兒樣本量少；因年齡跨度大，無法在嬰兒中按月齡區分參考值，且參考值區間大。其次，細胞亞群可能受到種族、地理位置、性別、環境因素等影響，導致參考值存在一定差異［1］，使國外研究數據在中國人中的應用價值受到影響。本文給出了中國3月齡健康足月嬰兒B細胞、NK細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+T和CD8+T細胞的第二信號受體CD28比例、CD8+T細胞的HLADR、CD38比例、Naive細胞比例、記憶T4細胞比例等參考值。本文盡管是橫斷面數據，但集中在3月齡嬰兒，更準確地反映這一年齡嬰兒的免疫功能，且所有標本均標準運送至同一實驗室進行檢測，避免相關檢測誤差，填補了3月齡這一特定月齡中國嬰兒數據的空白，可以為兒童保健及自身免疫病專家識別免疫功能缺陷的嬰兒提供參考數據。嬰兒期免疫功能監測的難點為隨訪依從性差、血樣稀缺，本研究的不足和局限也在于缺乏后續數據，不能評估免疫功能的動態變化。

除數量外，T細胞的功能也是評價疾病嚴重程度的指標。我們發現喂養方式對CD28表達（CD4+T細胞和CD8+T細胞）、HLA-DR表達（CD8+T細胞）有顯著影響，純母乳喂養者與純奶粉喂養者相比，淋巴細胞功能亞群CD28表達比例顯著降低，淋巴細胞激活亞群HLA-DR表達比例顯著增高。以往研究多為混合喂養，以母乳或奶粉為主，而本研究中為純母乳喂養或純奶粉喂養，更能反映喂養方式對免疫功能的影響。CD28是T細胞最重要的第二信號受體，其表達情況可作為T細胞功能的評估指標之一，如活化、細胞因子產生、增殖等。正常人CD4+T細胞90%以上表達CD28，缺乏CD28的CD4+T細胞無法被活化呈“無能”狀態［3］。HLA-DR+T細胞可免疫激活包括細胞活化、增殖、凋亡、細胞因子分泌等一系列過程，多種指標均可用來反映激活水平，目前應用較多的為CD8+T細胞表面的活化分子HLA-DR和CD38表達比例［9］。CD8+T細胞表面激活標記物HLA-DR的表達在母乳喂養組顯著高于奶粉喂養組，而CD38表達無顯著性差異。僅表達HLA-DR而CD38陰性的CD8+T細胞具有更好的細胞因子分泌、增殖及細胞毒作用。重癥感染時T細胞活化，如2019冠狀病毒病患者中，重癥和極重癥患者的HLA-DR表達較輕癥患者顯著增加［10］。艾滋病患兒CD8+T細胞活化程度與病毒載量呈正比［11］。但在健康嬰兒免疫系統發育過程中，CD8+T細胞活化的意義尚不明確。且有研究發現，HLA-DR在低齡兒童中表達更高，并隨年齡增長而降低［8］。本文中母乳喂養組的T細胞功能亞群顯著減少，激活亞群顯著增加，提示喂養方式對T細胞發育過程存在一定影響，說明母乳喂養嬰兒在3月齡時T細胞發育可能欠成熟，而并非感染表現。

國內的研究發現，1～6月齡男嬰的CD4表達（41.96個/μL）顯著低于女嬰（45.13個/μL），余細胞亞群指標無顯著性差異［4］。國外關于早產兒及足月兒的研究表明，校正胎齡自22～28周至44～55周，性別對淋巴細胞亞群均無顯著影響［1］。本研究中，性別對3月齡嬰兒的淋巴細胞亞群均無影響，但尚需更大樣本。

綜上，本研究提供了3月齡這一特定月齡中國健康足月嬰兒免疫功能參考值，尤其是淋巴細胞亞群，并發現純母乳喂養者與純奶粉喂養者相比，T細胞功能亞群顯著減少，激活亞群顯著增加，即喂養方式對T細胞發育及功能有顯著影響，是否與遠期疾病相關還需長期隨訪及更大樣本數據支持。