廣譜抗生素療程對極低出生體重兒糞便腸道菌群和短鏈脂肪酸影響的前瞻性研究

孫倩 王政力 劉曉晨 季艷春 賀雨 艾青 李祿全

（重慶醫科大學附屬兒童醫院新生兒診治中心/兒童健康與疾病國家臨床研究中心/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室/兒童發育重大疾病診治與預防國際科技合作基地/重慶市兒科重點實驗室，重慶 400014）

人類腸道與共生微生物之間的相互作用可能是人體中最多樣化的，其中細菌占較大比例。不同種類的細菌在宿主免疫系統成熟、腸道屏障功能和人類疾病中起著關鍵作用［1-2］。相較于正常出生體重兒，低出生體重兒腸道菌群的組成豐富度和多樣性降低［3］。研究表明經驗性使用抗生素會增加早產兒視網膜病變、壞死性小腸結腸炎［4］、晚發型敗血癥的發病率；同時影響遠期預后，如生長障礙、肥胖、過敏和自身免疫性疾病的風險增加［5］。

一方面，抗生素的使用會導致腸道菌群失衡和多樣性減少，缺乏有益的雙歧桿菌屬和狹窄梭菌屬1［6］，同時機會致病菌腸桿菌科、腸球菌和葡萄球菌增加［7］。另一方面，抗生素的使用會影響腸道菌群代謝產物短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）含量。SCFAs與多種疾病狀態的發生發展密切相關，如炎癥性腸病、1型糖尿病和非酒精性脂肪肝等［8］。

目前針對極低出生體重兒（very low birth weight infant，VLBWI）的相關研究，大多著眼于抗生素干預對腸道菌群的影響，研究結果顯示抗生素治療會降低腸道菌群的多樣性并且增加有害菌［9］。Arboleya等［10］探討了抗生素療程后菌群及3種SCFAs含量的改變，本研究擬進一步探討廣譜抗生素療程對VLBWI腸道細菌群落及大部分SCFAs的影響，并分析菌群與SCFAs之間的關聯。為合理使用廣譜抗生素提供科學依據，為進一步研究提供切入點。

1 資料與方法

1.1 研究對象

前瞻性選取2020年6～12月重慶醫科大學附屬兒童醫院新生兒診治中心收治的29例VLBWI為研究對象。納入標準：（1）患兒出生24 h內直接入住我科者；（2）胎齡<30周且出生體重<1 500 g者；（3）入院后因伴有感染、早產、母孕期高危因素并入住新生兒重癥監護室，使用廣譜抗生素治療者。所有納入對象根據血培養結果決定是否停用抗生素。排除標準：（1）住院期間死亡和放棄治療者；（2）合并先天性消化道畸形（如先天性腸閉鎖、先天性巨結腸、腸旋轉不良等）；（3）未完成腸道菌群、SCFAs測定者；（4）不愿參加本研究者。

本研究已經獲得重慶醫科大學附屬兒童醫院倫理委員會批準（No.2021-18）。參與這項試驗新生兒的父母已經簽署知情同意書。

1.2 分組

按抗生素療程分為≤7 d組［出生后經驗性使用了青霉素+頭孢菌素類藥物（總使用時間≤7 d）］和>7 d組［根據病情所需要，聯用了青霉素+頭孢菌素，或糖肽/碳青霉烯類藥物（總使用時間>7 d但≤28 d）］。本研究兩組使用的抗生素均為廣譜抗生素，均為殺菌劑。

1.3 標本采集

采用專用一次性糞便收集管收集兩組患兒住院后第14天和第28天糞便標本；立刻分裝，-80℃保存，備檢。早產兒腸道菌群具有多樣性低和穩定性差的特點，抗生素的治療及療程持續時間對腸道菌群有影響［9］。為給予抗生素反應時間以獲得較穩定的菌群及代謝結果，本研究僅在VLBWI第2周齡和第4周齡檢測了糞便菌群和SCFAs。

1.4 糞便樣本微生物群分析

使用QIAamp快速DNA糞便試劑盒（Qiagen，德國），按照制造商的說明書提取儲存的糞便標本的微生物基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA提取液。16S rDNA基因的V3+V4區域用指定引物放大。擴增過程：變性（95°C下3 min，95°C下30 s）、退火（55°C下30 s）、延伸（72°C下45 s）持續27個循環和額外延伸（72°C下10 min）。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒（Axygen Biosciences）進行回收，并使用Quantus?熒光儀（Promega，USA）進行定量。在Illumina MiSeq相關平臺上建立數據庫并進行測序。將質量分數<20的堿基和長度為>10 bp的重疊序列刪除。在拼接序列的重疊區域，刪除超過最大錯配率0.2的讀數。利用Uparse（7.1版）將處理后的序列劃分為操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），以97%的相似性閾值與OTU進行生物信息學聚類分析，對菌群數據進行Alpha多樣性分析（腸道菌群中物種的豐富度、多樣性分別用Chao指數值和Shannon指數值來體現，其中Chao指數值與菌群豐富度成正比，Shannon指數值與菌群多樣性成正比［11］）和群落組成分析。

1.5 糞便樣本短鏈脂肪酸分析

取100 mg糞便樣本至2 mL研磨管中，加入研磨珠，加入900μL甲醇和100μL的內標（甲醇配制的1 000μg/mL的2-乙基丁酸），冷凍研磨儀50 Hz研磨3 min，2次。冰水浴30 min，-20℃靜置30 min，13 000 g（4℃）離心15 min。將上清液轉移到1.5 mL離心管中。加入50 mg無水硫酸鈉，渦旋，13 000 g（4℃）離心15 min。取上清液運用安捷倫公司（Agilent Technologies Inc.CA，USA）的8890B-5977B GC/MSD氣質聯用儀檢測。最后用Masshunter定量軟件（美國Agilent公司，版本號：v10.0.707.0）對目標SCFAs（乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸、異己酸）進行自動識別和集成。通過標準曲線計算各樣品的SCFAs含量。

1.6 統計學分析

所有數據采用SPSS 24.0軟件進行統計學分析。正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗。非正態分布的計量資料用中位數和四分位數間距［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，組內比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗。計數資料采用例數和率（%）表示，組間比較采用Fisher確切概率法。采用Spearman秩相關分析變量之間的相關性。P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征

2020年6～12月本中心共收治60例VLBWI，其中住院期間死亡和放棄治療者7例，先天性消化道畸形9例，未完成腸道菌群和SCFAs測定者5例，不愿參加本研究者10例，最終共納入29例VLBWI。抗生素療程≤7 d組（n=9）和>7 d組（n=20）成功入組，所有入組患兒均母乳喂養。兩組VLBWI性別、胎齡、出生體重、入院年齡、住院時間、出生方式、胎膜早破、羊水污染、宮內窘迫、Apgar評分、喂養方式、中心靜脈置管持續時間，以及喂養不耐受、壞死性小腸結腸炎、新生兒敗血癥、化膿性腦膜炎發生率等比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 兩組不同抗生素療程VLBWI臨床指標對比

2.2 菌群單樣本Alpha多樣性分析

≤7 d組第4周和第2周相比，Chao指數顯著降低（P<0.05），Shannon指數差異無統計學意義（P>0.05）。>7 d組第4周和第2周相比，Chao指數顯著降低（P<0.05），Shannon指數變化差異無統計學意義（P>0.05）。第2周時，>7 d組和≤7 d組相比，Shannon指數變化差異無統計意義（t=1.12，P=0.285），Chao指數的變化差異無統計學意義（Z=-0.50，P=0.643）。第4周時，>7 d組和≤7 d組相比，Shannon指數差異無統計學意義（t=1.09，P=0.284），Chao指數變化差異無統計學意義（Z=-0.80，P=0.444）。見表2。

表2 兩組不同抗生素療程VLBWI糞便的菌群Alpha多樣性分析

2.3 菌群組成分析

組內比較：≤7 d組第4周與第2周的菌群相比，在屬水平上，狹窄梭菌屬1顯著升高（P=0.035），而不動桿菌屬顯著降低（P=0.035）；在門水平上，厚壁菌門顯著升高（P=0.022），而變形菌門顯著降低（P=0.022）。見圖1。

圖1 抗生素療程≤7 d組生后第2周和第4周菌群差異分析

組間比較：第4周時，在屬水平上，>7 d組的狹窄梭菌屬1較≤7 d組顯著降低（P=0.021）；在門水平上，>7 d組的厚壁菌門較≤7 d組顯著降低（P=0.008），而變形菌門顯著升高（P=0.010）。見圖2。

圖2 抗生素療程≤7 d組和>7 d組生后第4周的菌群差異分析

2.4 SCFAs測定

≤7 d組第4周與第2周相比，總SCFAs、丙酸、丁酸、戊酸含量顯著升高（P<0.05）。>7 d組第4周與第2周相比，總SCFAs、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸含量顯著升高（P<0.05）。見表3。

第4周時，>7 d組異丁酸（Z=-2.357，P=0.018）和戊酸（Z=-2.121，P=0.034）含量較≤7 d組顯著下降；>7 d組丙酸（Z=-0.707，P=0.501）、丁酸（Z=-1.839，P=0.069）、異戊酸（Z=-1.084，P=0.295）、己酸（Z=-0.990，P=0.340）和異己酸（Z=-0.283，P=0.799）含量與≤7 d組比較差異無統計學意義。見表3。

表3 兩組不同抗生素療程VLBWI糞便的SCFAs含量分析［M（P25，P75），μg/g］

2.5 菌群與糞便樣本SCFAs相關性分析

根據Spearman相關性熱圖分析，方法與Su等［12］和Tsukuda等［13］一致。在門水平上，厚壁菌門與丁酸含量呈顯著正相關（rs=0.36，P=0.012），變形菌門與丁酸（rs=-0.44，P=0.0017）和異丁酸（rs=-0.42，P=0.0025）含量呈顯著負相關；在屬水平上，狹窄梭菌屬1與異丁酸（rs=0.29，P=0.045）、丁酸（rs=0.57，P=0.00002）和戊酸（rs=0.41，P=0.0037）含量均呈顯著正相關。這提示SCFAs含量與腸道中某些類別菌的比例相關。見圖3。

圖3 腸道菌群與SCFAs的相關性

3 討論

抗生素的經驗性使用在VLBWI中較常見，抗生素的使用對腸道菌群有顯著影響［10］。本研究進一步發現廣譜抗生素療程可能會對VLBWI腸道細菌群落的豐富度、定植和演化，以及其代謝產物SCFAs的含量產生較大影響。

本研究發現抗生素療程≤7 d組第4周和第2周比較，Chao指數顯著降低；>7 d組，第4周和第2周比較，Chao指數也顯著降低。這提示抗生素療程治療后均可導致VLBWI的菌群豐富度顯著降低。抗生素療程>7 d組較≤7 d組Chao指數降低更明顯，進一步提示抗生素療程越長，菌群豐富度越顯著降低。有研究發現抗生素治療后會降低早產兒腸道菌群多樣性［9，14］。本研究中，抗生素療程≤7 d組第4周和第2周相比，Shannon指數差異無統計學意義；同時>7 d組，第4周和第2周相比，Shannon指數差異也無統計學意義。這提示抗生素療程治療后對VLBWI的菌群多樣性無明顯影響。本研究與其他研究結論存在差異的原因可能與本研究樣本量小有關。

通常隨著日齡的增長，早產兒厚壁菌門的比例增加而變形菌門的比例降低［9］。在本研究中，抗生素療程≤7 d組第4周與第2周的菌群相比，厚壁菌門顯著增加而變形菌門顯著降低。這提示≤7 d抗生素療程治療對腸道菌群的構成和演化影響較輕微和暫時，隨著抗生素停用和日齡增長有一定恢復的趨勢，與之前研究結果一致［10，14］。本研究中，抗生素療程>7 d組第4周與第2周的菌群相比，門水平和屬水平上均無顯著變化。這提示>7 d抗生素治療療程對菌群的構成和演化影響可能較嚴重，無顯著恢復趨勢。與其他研究結果顯示長期抗生素治療顯著改變了腸道菌群的組成一致［15］。第4周時，在門水平上，抗生素療程>7 d組較≤7 d組的厚壁菌門顯著降低而變形菌門顯著升高；在屬水平上，>7 d組較≤7 d組的狹窄梭菌屬1顯著降低。這提示>7 d的抗生素療程治療會導致有害菌或機會致病菌如變形菌門的比例顯著增加，有益菌屬如厚壁菌門及狹窄梭菌屬1的比例顯著降低，與對早產兒的腸道菌群的其他研究結果一致［16］。這可能是由于廣譜抗生素的較長時間應用，較強的抗菌活性導致有益菌一直處于受抑制狀態［15］。

SCFAs大多是未經小腸吸收利用的膳食纖維被大腸的腸道菌群發酵而生成的，且與菌群的種類和數量密切相關［17］。有研究表明，新生兒的腸道在出生時是有氧環境，然后逐漸變為厭氧環境，從而使厭氧菌（如梭菌和擬桿菌）得以定植［18］。異丁酸和戊酸大多是由厭氧菌發酵產生，其含量應隨著厭氧菌的定植增多而顯著升高［19］。本研究在第4周時，抗生素療程>7 d組的異丁酸和戊酸含量較≤7 d組顯著降低。這提示>7 d的抗生素療程治療會顯著減少VLBWI異丁酸和戊酸含量，與之前結果顯示抗生素療程會降低SCFAs含量及破壞腸道代謝的穩態一致［10，15］。異丁酸有助于降低代謝紊亂個體對胰島素的抵抗［20］，戊酸對神經系統有保護作用［21］，為功能性SCFAs。影響功能性SCFAs的含量可能對健康有影響。

為尋找精準干預靶點，本研究進一步探求特定菌群與SCFAs之間的關系。有研究顯示厚壁菌門和梭狀芽孢桿菌屬是產生SCFAs的優勢類別，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，糞便中的丁酸含量與梭狀芽胞桿菌相關系數最高［13］。本研究僅討論了組間SCFAs、菌群的測定結果具有顯著性差異且對應一致的菌的相關性，發現狹窄梭菌屬1與異丁酸、丁酸和戊酸含量呈正相關，且>7 d組的抗生素療程治療會顯著減少其豐度。這提示狹窄梭菌屬1可能是進一步相關研究的良好切入點。

本研究有一定的局限性。本研究只涉及來自同一家醫院的少量患兒樣本，未能進一步依據胎齡和體重進行分層分析。同時，本研究處于三級甲等醫院，收治的病例病情較為嚴重，因此未收集到胎齡小于30周且未使用抗生素的VLBWI作為對照組。本院未設有婦產科，本研究中的早產兒一經住院立即使用抗生素，故使用抗生素前的自身對照標本收集困難。

廣譜抗生素療程可能會導致胎齡小于30周的VLBWI腸道菌群的豐富度降低、定植和演化改變，以及其代謝產物功能性SCFAs含量降低。不利于腸道健康，臨床上應該嚴格把握廣譜抗生素的適應證及療程。