2017～2019年兒童諾如病毒相關性胃腸炎的分子流行病學研究

段美霖 胡月 唐香 許紅梅

（重慶醫科大學附屬兒童醫院感染科/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室/國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心/兒童發育重大疾病國家國際科技合作基地/兒科學重慶市重點實驗室，重慶 400014）

諾如病毒是引起兒童病毒性腹瀉的主要病原體之一，也是導致全球所有年齡段人群食源性疾病和胃腸炎暴發的主要原因［1］。諾如病毒相關性胃腸炎臨床上以嘔吐、腹瀉為主要表現，可伴有發熱、惡心、腹痛、厭食、乏力、驚厥等［2］，雖然大多數患者感染程度較輕，但也有出現住院、死亡等重癥病例，特別是在5歲以下兒童、65歲以上老年人和免疫力低下者［3］。據統計，諾如病毒每年可導致12%～24%的社區或診所胃腸炎病例、11%～17%的急診室或住院病例，以及大約7～20萬人死亡，且在兒童中發病率最高［1］。由此給全球帶來的社會經濟損失可高達603億美元［4］。

諾如病毒屬于杯狀病毒科諾如病毒屬，無包膜單股正鏈的RNA病毒。人諾如病毒基因組包括3個開放閱讀框（open reading frames，ORFs），編碼結構蛋白和非結構蛋白。根據衣殼區及聚合酶區基因序列，可分為10個基因組（GⅠ-GⅩ）及8個P組，包括49個衣殼基因型及60個P型［5］。GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅧ及GⅨ可感染人，而最為常見的為GⅠ和GⅡ［6］。諾如病毒具有高變異性，持續檢測兒童諾如病毒相關性胃腸炎的病原學特征、基因型變遷，有助于諾如病毒感染的預防和控制。本研究對2017～2019年期間在重慶醫科大學附屬兒童醫院門診就診的1 458例急性胃腸炎患兒中諾如病毒的分子流行病學特征進行分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性收集2017年1月至2019年12月期間就診于重慶醫科大學附屬兒童醫院的急性胃腸炎患兒1 456例的臨床資料。所有患兒均符合急性腸胃炎診斷標準［7］及納入標準：（1）大便次數增加（每日排便次數3次或以上）；（2）糞便性狀改變（包括水樣便、稀便）；（3）大便常規提示白細胞及紅細胞計數均≤10個/高倍鏡視野（+）；（4）病程不超過2周。本研究已獲得我院醫學倫理委員會批準［（2020）年倫審（研）第（154）號］。

1.2 樣本的處理和病毒RNA提取

共采集糞便樣本1 458份，其中2例患兒分別于不同病程各采集1份糞便樣本，男860份，女598份。取0.2 mL大便樣本或豌豆大小糞便量，加入0.8 mL PBS緩沖溶液，充分混勻配制成20%的混懸液，離心后獲取上清液，采用德國QIAGEN公司病毒核酸提取試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書，提取病毒RNA。

1.3 VP1區序列擴增及測序

采用美國Invitrogen公司RNA逆轉錄試劑盒逆轉 錄 合 成cDNA，選 擇GISKF/GISKR（GI）、CoG2F/G2SKR（GII）作為引物［8］，應用大連寶生物有限公司的TaKaRa Premix Taq試劑盒擴增諾如病毒的VP1區序列。反應體系：上下游引物（10μmol/L）各1μL，cDNA 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，dNTP Mix（2.5 mol/L）2.0μL，MgCl2（25 mmol/L）2.5μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.15μL，ddH2O 13.35μL。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環35次；最后72℃延伸7 min，4℃終止。將1.5%瓊脂糖凝膠電泳陽性的PCR產物外送上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.4 序列分析

采用DNAstar軟件對測定序列進行編輯，利用PubMed在線BLAST功能進行比對，諾如病毒基因在線分型工具（https：//www.rivm.nl/mpf/typingtool/norovirus/）檢索其基因型。應用MEGA 5.05軟件進行多序列比對，使用Neighbor-joining法、Kimura2-parameter模型構建親緣進化樹，Bootstrap檢驗進化樹的可靠性，重復檢驗1 000次。

1.5 統計學分析

使用SPSS 23.0統計軟件對數據進行統計學分析，計數資料用頻數和百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 諾如病毒檢測結果

2017～2019年采集符合納入標準的兒童腹瀉樣本1 458份，諾如病毒陽性檢出率為10.84%（158/1 458）；2017年陽性檢出率為10.0%（48/482），2018年陽性檢出率為12.3%（60/489），2019年陽性檢出率為10.3%（50/487），不同年份諾如病毒陽性檢出率比較差異無統計學意義（χ2=1.588，P>0.05）。檢出的諾如病毒主要為GⅡ型（97.5%，154/158），GⅠ型僅4例（2.5%，4/158）。

2.2 諾如病毒感染性別分布

158例諾如病毒陽性患兒中，男性檢出率為12.2%（105/860），女性檢出率為8.9%（53/598），男性檢出率明顯高于女性（χ2=4.088，P=0.043）。

2.3 諾如病毒感染年齡分布

納入研究的患兒年齡分布從1月齡至165月齡，依次分為<6月齡、6月齡～、12月齡～、18月齡～、24月齡～、≥36月齡組，諾如病毒陽性率分別為3.1%（9/292）、13.5%（66/490）、16.9%（51/301）、13.4%（19/142）、6.2%（6/97）、5.1%（7/136），各年齡組間諾如病毒陽性率比較差異有統計學意義（χ2=40.982，P<0.001）。兒童諾如病毒相關性胃腸炎的發病年齡以小于2歲為主，占比為95.6%（151/158）。諾如病毒陽性率最高的年齡組為12～<18月齡組（16.9%），占所有諾如病毒陽性患兒的32.3%（51/158）。

2.4 諾如病毒感染時間分布

2017～2019年兒童諾如病毒相關性胃腸炎的各月監測結果分析顯示，諾如病毒感染流行月份主要為8～10月份，不同年份略有波動。2017年諾如病毒檢出高峰在8、9月份，檢出率分別為32%（13/41）、31%（21/67）；2018年諾如病毒檢出高峰在9、10月份，檢出率分別為28%（13/47）、40%（16/40），同年5月份有一個小高峰，檢出率為25%（4/16）；2019年諾如病毒檢出高峰在9、10月份，檢出率分別為31%（15/48）、33%（20/60）。見圖1。

圖1 2017～2019年重慶地區兒童諾如病毒性胃腸炎病例的月份分布情況

2.5 諾如病毒感染臨床特征

諾如病毒陽性患兒臨床上以腹瀉（100%，158/158）為主要表現，可伴隨嘔吐（79.1%，125/158）、發熱（29.1%，46/158）、腹痛（1.3%，2/158）、脫水（1.3%，2/158）、精神萎靡（1.3%，2/158）等癥狀。92.4%（146/158）的患兒糞便性狀呈水樣便，少數為稀便（7.6%，12/158）；大便常規顯示有28例患兒檢出白細胞［≤10個/高倍鏡視野（+）］，4例患兒檢出紅細胞［≤10個/高倍鏡視野（+）］，合并輪狀病毒（膠體金法檢測）感染有23例（14.6%）。

2.6 諾如病毒的基因型分布

經過核酸序列比，在158份陽性樣本中共檢出8種基因亞型，其中以GⅡ.4為主，占69.6%（110/158），且99份為GⅡ.4 Sydney 2012，占62.7%（99/158）；其次為GⅡ.3，占15.2%（24/158）；GⅡ.2占10.1%（16/158）；GⅡ.6占1.9%（3/158）；GⅡ.17占0.6%（1/158）；GⅠ.3占1.3%（2/158）；GⅠ.2、GI.5各占0.6%（1/158）。GⅡ.4 Sydney 2012在2017～2019年每年都占有明顯優勢，在7～12月份為主要流行株，但2～4月卻無檢出。在1月和3～5月，GⅡ.3則成為主要流行株。GⅡ.6、GⅡ.17、GⅠ.2、GⅠ.3、GⅠ.5散發在不同月份，且2017年無GⅠ檢出，2018年、2019年各檢出2例。見圖2。

圖2 2017～2019年重慶地區兒童諾如病毒性胃腸炎的基因型分布

隨機選取各基因型代表序列與GenBank數據庫中下載的參考株，構建諾如病毒衣殼區的分子遺傳進化樹。本研究中15株GⅡ.4 Sydney 2012毒株與臺灣株GⅡ.4 Sydney 2012 MH979230.1在同一遺傳支，同源性在96.8%～100%；13株GⅡ.3毒株與浙江株GⅡ.3 KY433576.1同源性在97.0%～100%；13株GⅡ.2毒株與俄國株GⅡ.2 MK886705.1同源性在98.3%～100%；3株GⅡ.6毒株與巴西株GⅡ.6 KX154761.1同源性在99.3%～99.7%；1株GⅡ.17毒株與江蘇株GⅡ.17 KU720506.1同源性為100%；1株GⅠ.5毒株與韓國株GI.5 MN494557.1同源性為99.7%；2株GⅠ.3毒株與韓國株GⅠ.3 MW532368.1同源性在93.4%～100%，其中GI.3 CQNV42012018CHN與韓國株GI.3 MN421672.1同源性在99.7%；1株GⅠ.2與俄國株GI.2 MF615618.1同源性為98.4%。見圖3。

圖3 諾如病毒衣殼區系統進化樹

3 討論

諾如病毒是導致兒童急性病毒性腹瀉第2位病原，在部分地區甚至越居第1位［9］，因而越來越受到重視，但目前諾如病毒疫苗仍處于研發階段，進展最快的候選疫苗處于臨床實驗的IIb期［10］，迄今為止尚無有效的上市疫苗。因此，對諾如病毒流行特征及基因型變遷的監測至關重要。

本研究顯示2017～2019年1 458份急性胃腸炎患兒糞便標本中，3年諾如病毒的檢出率分別為10.0%、12.3%、10.3%，總檢出率為10.84%。相比于同地區2012～2014年的諾如病毒檢出率（21.9%、15.6%、13.1%）均降低［11-13］，但與2015年的諾如病毒檢出率10.7%相當［14］。這提示2017～2019年諾如病毒陽性率波動幅度較小，較2012～2014年有下降趨勢，一方面可能與本地區經濟發展、衛生條件改善相關；另一方面可能與監護人健康意識的提高，輕癥腹瀉自行予以對癥處理有關。與同時間段我國南北城市的諾如病毒監測情況比較，云南省疾病預防控制中心調查顯示自云南、四川等省的各腹瀉監測點采集2017～2019年的兒童腹瀉樣本中有10.43%檢出諾如病毒［15］，本地區與之相當，但李潔等［16］監測數據顯示北京地區諾如病毒檢出率為7.5%，石鑫等［17］收集黑龍江哨點醫院腹瀉標本研究諾如病毒感染的流行特征時發現7.14%的樣本檢出諾如病毒。

上述中國南北方諾如病毒陽性率的差異，可能與經濟、氣候、居住環境、飲食生活習慣、健康意識、人群易感性等有關，而這一方面的研究國內少見。據報道，濕度變化有利于輪狀病毒的持久性，增加了通過受污染表面傳播的風險［18］，由此推測濕度可能也會影響諾如病毒的持久性。也有研究表明極端天氣變化可能影響病毒性胃腸炎的發生，例如厄爾尼諾南方濤動，就被確認是病毒性胃腸炎發生的重要危險因素［19］。而具體到諾如病毒而言，包括濕度、溫度、降雨、大風、洪水等多種環境因素，對諾如病毒感染是否具有影響，需要諾如病毒與氣候條件的同步監測，以進一步研究。人群對諾如病毒易感性很大程度取決于腸道上皮表面是否存在組織血型抗原和非分泌者的巖藻糖轉移酶2基因突變，從而導致相應酶的活性喪失，腸道上皮細胞不能表達血型抗原，從而抵抗大部分諾如病毒的顯性感染，非分泌者感染諾如病毒的風險低于分泌者［20］。對于我國不同區域人群組織血型抗原表達情況與諾如病毒感染的關系，仍然需要進一步研究。

本研究結果顯示諾如病毒流行高峰在8～10月份，與本地區既往監測情況大致相當［11-12］。在中國中部地區，例如湖北省則以10～12月份為流行高峰［21］，而黑龍江、北京等北方地區，流行高峰卻在2月份［16-17］。諾如病毒全球季節模式顯示其流行高峰期在冬季，提示溫度與諾如病毒流行存在一定相關，同時研究亦有提出降雨量與季節性存在正相關［22］。我國不同區域的諾如病毒流行的月份差異亦有可能與氣溫、降雨量有關。而這種差異性，或許對今后不同區域的疫苗接種時間的決策提供參考。

兒童諾如病毒相關性胃腸炎的發病年齡以小于2歲為主。諾如病毒陽性率最低的年齡組為<6月齡（3.1%），考慮可能與從母體獲得的保護性抗體有關，同時亦可能與這一年齡階段患兒活動范圍小，接觸感染的機會較低有關。本研究男性患兒諾如病毒陽性率較女性患兒更高，男性被認為是兒童諾如病毒相關性胃腸炎的危險因素［23］，這可能與男性患兒衛生意識較低，活動范圍較廣，接觸病毒感染的機會更多有關。

本研究結果顯示兒童急性胃腸炎中諾如病毒感染仍以GII.4為主，這與我國多省市地區監測結果相符［24］。由于諾如病毒具有高變異性，在抗原漂移、基因重組的雙重作用下，約每2～4年便會出現一個新的GII.4變異株以替代既往流行的GII.4變異株，但自2012年來，GII.4 Sydney 2012一直持續流行［25］，本研究亦顯示了GII.4 Sydney 2012為本地區2017～2019年流行的主要流行株。有研究認為帶有GⅡ.4 Sydney 2012衣殼的病毒通過重組進化持續存在［25］。

GII.3在人群中長期廣泛流行，在本研究中GII.3處在諾如病毒基因型檢出的第2位，而何菲等［26］研究天津市兒童GII感染情況時則發現GII.3檢出率甚至高于GII.4，但根據全球數據顯示，GII.3仍是次于GII.4的導致兒童諾如病毒相關性胃腸炎的基因型［23］，對于GII.3今后是否超越GII.4成為主要優勢株，需要進一步監測。GII.17自1978年第1次報道以來，常為零星感染，而且該基因型較GII.4、GII.3在成年人的暴發感染中更常見［27］，而在2014～2015年，GII.17在亞洲部分地區，例如中國廣東地區及日本［27-28］，短暫替代GII.4 Sydney 2012，成為諾如病毒暴發流行的主要基因型，而后該基因型再次呈現零星感染，主要流行株仍為GII.4 Sydney 2012。GI在人群中感染率較低，根據Mans等［29］對1997～2018年諾如病毒流行病學及基因型分布的相關數據進行統計和分析，結果顯示GI基因組中最為流行的毒株為GI.3基因型。本研究中GI在2017年未檢出，這與本地區既往2012年、2014年、2015年未檢出結果一致［11-12，14］，但在2018及2019年各檢出2例，說明今后本地區需注意GI感染的監測。大體上看本地區GI感染率低，基本符合全球范圍內流行趨勢，GI基因組在人群中感染率較低，或許與其變異性較低、病毒間交叉保護作用等相關。

綜上所述，本研究顯示2017～2019年間諾如病毒仍是引起兒童急性胃腸炎中的重要病原之一，陽性率為10.84%。其流行高峰在8～10月份，兒童諾如病毒相關性胃腸炎的發病年齡以小于2歲為主，男性患兒諾如病毒陽性率較女性患兒更高。GII.4 Sydney 2012為主要流行株，GII.3、GII.2次之，GI偶有檢出。諾如病毒的流行病學受到地區經濟、氣候、居住環境、飲食生活習慣、健康意識、人群易感性等多方面因素影響，對兒童諾如病毒相關性胃腸炎的時間分布、人群分布、臨床特征、基因型分布等的持續監測，可為本地區兒童諾如病毒相關性胃腸炎的預防與控制提供重要支持。