咳嗽變異性哮喘患兒外周血miR-138及RUNX3對Th1/Th2平衡的調節作用

王志剛 申改青 黃玉煥

（南陽市第一人民醫院新生兒重癥監護室，河南南陽 473200）

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）是一種特殊類型的哮喘，臨床上以咳嗽為主要癥狀甚至是唯一癥狀。在學齡前期和學齡期兒童中常見，以反復發作和遷延不愈為特點。因此探索CVA的發病機制，合理治療對避免CVA發展為典型哮喘具有一定幫助。近年來，T輔助細胞反應的不平衡一直受到關注，T輔助細胞分為兩大類，Th1和Th2［1］。Th1細胞主要分泌白細胞介素（interleukin，IL）-2、干 擾 素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF），它們參與細胞感染的防御機制［2］。Th2細胞主要分泌的細胞因子有IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13，參與過敏性炎癥反應［3］。然而，在哮喘患者中觀察到Th1/Th2失衡，Th2過度反應使其分泌的細胞因子增多，引發一連串免疫激活反應，導致IgE產生增加，促進嗜酸性粒細胞的生長和分化及黏液分泌增加，誘發氣道炎癥［4］。有研究顯示，葉乙醇提取物通過抑制過敏性哮喘小鼠模型中的核轉錄因子-κB信號轉導和組胺分泌，調節Th1/Th2失衡，從而減輕小鼠氣道炎癥反應［5］。間充質干細胞條件培養基通過調節CD4+T細胞向Th1/Th2效應細胞分化，可緩解卵清蛋白誘導的小鼠哮喘反應［6］。這些研究表明調節Th1/Th2平衡可能是治療CVA的一種新穎策略。

Runt相關轉錄因子3（Runt-related transcription factor 3，RUNX3）由高度保守且結構相似的RUNX基因家族編碼，分布于外周血和免疫系統中，RUNX3蛋白表達失衡與多種疾病有關［7-9］。RUNX3在T細胞發育中具有關鍵功能，參與T輔助細胞分化，具有增強IFN-γ分泌和抑制IL-4分泌的雙重作用，還可作用于T細胞的分化，影響Th1/Th2的平衡［10］。因此RUNX3對Th1/Th2平衡具有一定調節作用，有可能成為治療哮喘的潛在靶點。微小RNA（microRNA，miR）是18～22個核苷酸組成的非編碼RNA，是基因表達的微妙調控因子，在多種疾病中發揮作用，尤其是在慢性多因素疾病如哮喘［11］。有研究顯示，miR-138在哮喘中可調節樹突狀細胞介導的Th2型免疫反應，參與哮喘的發病［12］。另有研究顯示在銀屑病中miR-138可通過靶向調節RUNX3的表達影響Th1/Th2的平衡［13］。因此本文探討miR-138和RUNX3對CVA Th1/Th2平衡的影響，并進一步分析二者間是否具有靶向作用，為CVA的臨床治療提供方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2019年1月至2021年1月在我院接受治療的CVA患兒65例納入CVA組，其中男35例，女30例，年齡（8.7±2.6）歲。納入標準：（1）CVA患兒的診斷符合《中國兒童慢性咳嗽診斷與治療指南（2013年修訂）》［14］；（2）均為首次確診患兒。排除標準：（1）合并肺結核或肺部感染；（2）合并免疫性疾病或過敏性疾??；（3）近期服用過免疫抑制劑或抗生素；（4）合并血液系統疾??；（5）合并腫瘤。同期選取健康受試者30例納入健康對照組，排除近3個月有呼吸道感染史或有哮喘史的兒童，其中男18例，女12例，年齡（7.3±2.0）歲。兩組兒童性別構成比和年齡比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經過醫院倫理委員會批準（20181576），家屬知情同意。

1.2 外周血中CD4+T細胞的分離培養

收集CVA組和健康對照組兒童外周靜脈血樣本，乙二胺四乙酸抗凝后保存待用。通過Ficoll分離液溶液（北京索萊寶科技有限公司）梯度離心分離外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），利用RPMI培養基洗滌并重懸于RPMI培養基中。然后將PBMC與抗CD4+單克隆抗體的磁珠包被，分離CD4+T細胞，采用完全T細胞培養基（RPMI1640培養基，10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素，50μmol/Lβ-巰基乙醇，100 U/mL IL-2）培養CD4+T細胞。

1.3 ELISA法檢測IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-13水平

收集CVA組和健康對照組兒童CD4+T細胞的培養上清液，根據ELISA試劑盒說明書檢測IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-13的濃度。

1.4 流式細胞儀檢測Th1和Th2細胞所占比例

收集CVA組和健康對照組CD4+T細胞，加入10μL IFN-γ或IL-4細胞因子，促進T細胞向Th1細胞和Th2細胞分化，放置恒溫箱中孵育4 h。加入10μL CD3-PC5和CD8-PC7單克隆抗體，室溫避光孵育15 min。加入固定液，再次放置15 min。加入3 mL PBS溶液，3 000 r/min離心5 min，棄上清。加入10μL IL-4-藻紅蛋白單克隆抗體、IFN-γ-異硫氰酸熒光素單克隆抗體避光孵育15 min。各管加入3 mL PBS，3 000 r/min離心5 min，棄上清。0.5 mL PBS溶液重懸細胞，流式細胞儀檢測Th1、Th2細胞百分比。

1.5 實時熒光定量PCR檢測CD4+T細胞中RUNX3 mRNA的表達水平

利用TRIzol試劑（上海聯邁生物工程有限公司）提取CD4+T細胞的總RNA。根據TaKaRa RNA反轉錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司）說明書將總RNA反轉錄為cDNA，反轉錄條件：37℃15 min，85℃5 s。以cDNA為模板，RUNX3上游引物序列5'-UACCGACCGAGCACAUCCAU-3'，下游引物序列5'-AGCCGCGAGGACUCGAUCCU-3'；以管家基因U6 mRNA水平作為內參照，U6上游引物序列5'-UCAAGCACGAUCAUGAU-3'，下游引物序列5'-GUCAAGUUAGGUCGGUA-3'。按照TaKaRa實時熒光定量PCR試劑盒（寶生物工程大連有限公司）說明書進行PCR擴增。PCR擴增反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.6 Western blot檢測CD4+T細胞中RUNX3蛋白表達水平

提取CD4+T細胞的總蛋白，經BCA蛋白定量，取30μg蛋白，經SDS-PAGE分離。將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜上。1%BSA室溫封閉2 h，加入anti-RUNX3或anti-β-actin抗體（1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜。次日，加入相對應的二抗（1∶4 000稀釋），室溫孵育1 h。滴加化學發光劑，在Amersham Imager 600凝膠成像系統中拍照曝光。RUNX3蛋白表達水平以RUNX3蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值表示。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗

Starbase數據庫顯示，miR-138基因序列中GUGGUCG堿基與RUNX33'UTR野生型（wild type，WT）基因序列中CACCAGC堿基配對，形成沉默復合體，阻礙RUNX3基因轉錄翻譯，降低RUNX3蛋白表達水平；RUNX33'UTR突變型（mutation type，MUT）基因序列中與miR-138基因序列互補配對的堿基突變為CGUAUCG（圖1）。根據RUNX3突變位點設計WT和MUT熒光素酶報告載體，分別設置RUNX3 WT組、RUNX3 WT+miR-138 mimic組、RUNX3 MUT組和RUNX3 MUT+miR-138 mimic組，各組對應加入RUNX3 WT熒光素酶報告載體、RUNX3 WT熒光素酶報告載體+miR-138 mimic、RUNX3 MUT熒光素酶報告載體、RUNX3 MUT熒光素酶報告載體+miR-138 mimic。采用LipofectamineTM2000轉染試劑輔助共轉染至CD4+T細胞中，轉染48 h后，PBS清洗1次，每孔加入100μL裂解液，室溫震蕩10 min，收集細胞裂解液。每組取20μL細胞裂解液與10μL熒光素酶檢測試劑快速混勻后，用生物發光檢測儀檢測各組熒光值。

圖1 miR-138靶向調節RUNX3

1.8 RUNX3-mimic質粒轉染CVA組CD4+T細胞

將CD4+T細胞接種于6孔板中，每孔40萬個細胞，培養24 h后，隨機分為對照組、NC-mimic組和RUNX3-mimic組，每組設3個復孔，參照Lipofectamine 2000說明書，NC-mimic組和RUNX3-mimic組分別轉染NC-mimic（對照質粒）、RUNX3-mimic質粒，對照組不予轉染（質粒均由湖南豐暉生物科技有限公司合成）。轉染6 h后，更換新的培養基，繼續培養48 h，收集各組細胞，采用Western blot檢測轉染效率。然后檢測對照組、NCmimic和RUNX3-mimic組間IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-13水平及Th1、Th2細胞比例。

1.9 統計學分析

采用SPSS 21.0統計軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組間Th1、Th2細胞比例及其分泌主要細胞因子水平變化

CVA組與健康對照組相比，Th1分泌的主要細胞因子IFN-γ和IL-2水平降低，Th2分泌的主要細胞因子IL-4、IL-5和IL-13水平增加（P<0.001）。CVA組Th1細胞比例和Th1/Th2比值低于健康對照組，Th2細胞比例高于健康對照組（P<0.05）。見表1。

表1 兩組間Th1、Th2細胞比例及其分泌主要細胞因子水平比較 （±s）

表1 兩組間Th1、Th2細胞比例及其分泌主要細胞因子水平比較 （±s）

注：［IFN-γ］干擾素-γ；［IL］白細胞介素。

組別健康對照組CVA組t值P值Th1/Th2 4.2±1.2 1.2±0.3 4.263 0.005 n 30 65 IFN-γ(ng/L)564±62 322±24 23.652<0.001 IL-2(ng/L)305±32 174±21 32.145<0.001 IL-4(ng/L)136±14 252±18 15.214<0.001 IL-5(ng/L)126±16 284±21 18.325<0.001 IL-13(ng/L)176±15 326±28 20.625<0.001 Th1(%)8.4±1.6 3.8±0.5 8.201<0.001 Th2(%)1.5±0.4 2.3±0.8 3.652 0.026

2.2 兩組外周血CD4+T細胞RUNX3 mRNA及其蛋白表達水平變化

CVA組外周血CD4+T細胞RUNX3 mRNA相對表達水平為0.42±0.10，低于健康對照組（3.14±0.16，t=8.251，P<0.001）。CVA組外周血中CD4+T細胞RUNX3蛋白相對表達水平為0.14±0.03，低于健康對照組（1.16±0.12，t=5.965，P<0.001），見圖2。

圖2 Western blot檢測兩組外周血CD4+T細胞RUNX3蛋白表達電泳圖

2.3 CVA組miR-138的表達水平及與RUNX3的靶向調節作用

CVA組miR-138的相對表達水平為2.35±0.21，高于健康對照組（0.41±0.07，t=6.458，P<0.001）。RUNX3 WT組、RUNX3 WT+miR-138 mimic組、RUNX3 MUT組和RUNX3 MUT+miR-138 mimic組間相對熒光素酶活性分別為1.02±0.23、0.42±0.09、1.10±0.12、1.07±0.18，4組比較差異有統計學意義（F=9.251，P<0.001）。RUNX3 WT+miR-138 mimic組相對熒光素酶活性低于RUNX3 WT組（P=0.008），而RUNX3 MUT組和RUNX3 MUT+miR-138 mimic組相對熒光素酶活性與RUNX3 WT組相比差異無統計學意義（P>0.05）。

2.4 增加CD4+T細胞中RUNX3的表達對Th1/Th2及其分泌的主要細胞因子的影響

對照組、NC-mimic組和RUNX3-mimic組的RUNX3蛋白灰度值分別為0.56±0.12、0.62±0.14和1.52±0.17，三組比較差異有統計學意義（F=8.634，P<0.001），且RUNX3-mimic組RUNX3蛋白灰度值高于對照組和NC-mimic組（P<0.001）（圖3）。與對照組和NC-mimic組相比，RUNX3-mimic組中IFN-γ和IL-2水平升高，IL-4、IL-5和IL-13水平降低，Th1細胞比例和Th1/Th2比值增加，Th2比值細胞比例降低（P<0.05），見表2。

表2 增加CD4+T細胞中RUNX3的表達對Th1/Th2及其分泌主要因子的影響 （n=3，±s）

表2 增加CD4+T細胞中RUNX3的表達對Th1/Th2及其分泌主要因子的影響 （n=3，±s）

注：［IFN-γ］干擾素-γ；［IL］白細胞介素。a示與對照組和NC-mimic組相比，P<0.05。

組別對照組NC-mimic組RUNX3-mimic組F值P值Th1/Th2 1.2±0.5 1.2±0.4 3.8±1.0a 4.210 0.006 IFN-γ(mg/L)307±17 315±19 378±25a 11.251<0.001 IL-2(mg/L)186±15 180±18 284±19a 15.654<0.001 IL-4(mg/L)236±18 248±16 124±14a 16.632<0.001 IL-5(mg/L)282±15 276±22 140±19a 17.625<0.001 IL-13(mg/L)275±17 270±18 147±13a 18.142<0.001 Th1(%)3.2±0.8 3.5±0.9 7.3±1.8a 6.625<0.001 Th2(%)2.1±0.4 2.3±0.6 1.7±0.4a 3.854 0.010

圖3 Western blot法檢測各組CD4+T細胞中RUNX3蛋白表達電泳圖

3 討論

眾所周知，Th1/Th2細胞失衡及其分泌的細胞因子與哮喘的發生密切相關。在生理條件下，Th1和Th2細胞之間存在動態平衡，當這種平衡被打破時，會誘發哮喘發生［15］。Th2細胞主要產生IL-4、IL-5和IL-13，它們可增加血清中的IgE水平并募集嗜酸性粒細胞，誘導氣道高反應［16］。Th1細胞分泌IFN-γ和IL-2可拮抗Th2誘導的免疫反應并抑制哮喘的發展［17］。本研究發現CVA組的IL-2和IFN-γ水平低于健康對照組，而IL-4、IL-5和IL-13水平高于健康對照組，表明CVA患兒存在Th1/Th2細胞失衡。通過提高Th1細胞水平同時抑制Th2細胞水平以恢復Th1/Th2平衡，應該是治療哮喘的有效策略。已有研究顯示，調節Th1/Th2細胞因子失衡可以減輕哮喘的炎癥反應［15-18］。目前調節Th1/Th2平衡的主要為化學藥物制劑，在本研究中主要探討miRNA對Th1/Th2平衡的調節作用。因為miRNAs具有獨特的特性，且易于合成和操作，在治療疾病方面具有一定優勢，另外其在哮喘中起著不可或缺的作用。

本研究中，CVA組miR-138的表達水平高于健康對照組，推測其可能參與哮喘的發病。以往有研究顯示在銀屑病中，miR-138可靶向調節RUNX3，緩解Th1/Th2的失衡［13］。在本研究中通過熒光素酶活性試驗檢測結果顯示miR-138亦可直接靶向調節RUNX3。通常miRNAs通過調節相關靶基因來發揮作用，因此值得尋找miRNA相關的靶基因，并分析其對Th1、Th2的影響，為CVA的治療提供方向。以往有研究顯示miRNAs參與氣道重塑誘發支氣管哮喘發?。?9-22］。然而miR-138靶向調節RUNX3后對Th1/Th2平衡是否存在影響，本研究通過轉染實驗增加RUNX3的表達水平后可改善Th1/Th2失衡，表明RUNX3對Th1/Th2平衡有一定調節作用。RUNX3對Th1/Th2平衡調節可能的作用機制如下：在Th1細胞分化過程中，RUNX3在CD4+T細胞中的表達增加，并以正反饋方式作用于T-bet轉錄因子［23］。T-bet是Th1細胞分化和IFN-γ分泌的啟動子，同時抑制Th2相關的免疫事件［24］。另有研究表明RUNX3可以減弱Th2相關轉錄因子，后者是Th2分化的主要調節因子，并且是Th2介導的免疫反應所必需的［13］。

綜上所述，CVA患兒存在Th1/Th2失衡、miR-138表達水平增加，RUNX3表達水平降低，miR-138可直接靶向調節RUNX3。增加RUNX3的表達水平后可改善Th1/Th2失衡，為CVA的治療提供新的方向。