飼料防霉拮抗菌的篩選

文│周啟升 馬峰（山東省新泰市畜牧獸醫事業發展服務中心）鞠瑞成（山東百沃生物科技有限公司）于建（山東農大肥業科技有限公司）劉訓理（山東農業大學）

畜禽飼料在儲藏過程中十分容易受黃曲霉等霉菌的污染，產生次級代謝物黃曲霉毒素（Aflatoxins），不僅可引起各種動物的急性、慢性中毒，而且具有致癌、致畸、致突變的作用，飼料中黃曲霉毒素在畜禽類產品中聚積，最終也會威脅到人類健康。鑒于此，本研究以黃曲霉等引起飼料霉變的常見霉菌為靶標，利用對峙培養法和抑菌圈法，從泰山土壤中分離篩選出7株飼料常見霉菌的拮抗菌，其中編號為S24的菌株抑菌效果尤為明顯，為進一步研究利用微生物之間的拮抗作用及拮抗菌產生的活性物質預防飼料中霉菌的生長與產毒提供參考。

一、材料與方法

1.材料。黃曲霉（Aspergillus flavus），黑曲霉（Aspergillus niger），赭曲霉（Aspergillus alutacells）， 煙曲霉（Aspergillus fumigatus），由國家糧食和物資儲備局科學研究院提供。高氏一號培養基、PDA培養基等。

2. 方法。

拮抗菌的分離與篩選。稱取采集的營養豐富的泰山土樣10克，放入無菌研缽中研碎，加100毫升無菌水制成10-1的土壤稀釋液。搖床振蕩30分鐘，靜置5分鐘后，吸取上清液1毫升，做系列稀釋，梯度依次為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。用移液器吸取50微升土壤稀釋液滴于直徑為7.5厘米的培養基（細菌分離采用PDA培養基，放線菌分離采用高氏一號培養基）平板中，用無菌涂布器將稀釋液涂勻。將接種好的培養皿倒置放入培養箱中，30℃培養，從12小時開始有明顯的菌落出現。根據微生物菌落的形狀、大小、表面結構、邊緣形狀、質地、光澤、透明度、顏色和產生的可溶性物等特征，將單菌落一一挑出，轉移到相應的PDA培養基平板上培養。若菌落重疊則進行再次分離，直至形成單菌落。

拮抗活性檢測。用接種環挑取純化的菌落，點在距PDA培養基平板中央兩端2厘米處，28℃培養48小時后，將長滿黃曲霉的平板培養基用打孔器切下直徑為5毫米的菌盤接種于PDA培養基平板中央，培養96小時后，觀察抑菌情況，測量抑菌帶寬度，保留拮抗效果優良的菌株。

發酵液活性檢測。將拮抗效果優良的菌株進行復合培養基發酵，獲取無菌培養濾液后，將生測培養基熔化后，溫度降至55℃時，加入黃曲霉孢子懸液，使黃曲霉孢子的濃度為2×104～4×104CFU/毫升，將培養基孢子懸液倒入培養皿，20毫升/培養皿，制成混菌平板。抗菌物質的生物活性檢測采用牛津杯法，十字交叉法測量抑菌圈直徑，根據抑菌圈直徑大小篩選抗黃曲霉活性高的菌株。

拮抗菌繼代培養及保存。對篩選出的拮抗菌連續傳代培養10代，重新運用平板對峙培養法測定抗菌活性，保留前后抑菌活性無明顯變化的拮抗菌。臨時保存采用PDA斜面4℃低溫冰箱保存；長期保存接種于干燥、無菌的沙土管，-20℃冰箱保存。

◎圖1 S24菌株對飼料中常見霉變真菌的拮抗效果

◎圖2 黃曲霉拮抗菌發酵液對黃曲霉的抑制效果

◎圖3 S24菌株發酵液對飼料中常見霉變真菌的拮抗效果

二、結果與分析

1.拮抗菌株的分離與篩選。對特殊環境下采取的土樣進行分離，獲得純化細菌及放線菌分離株，通過平板對峙培養法進行抗菌活性檢測，其中10個菌株對黃曲霉等能引起飼料霉變的常見菌具有較強的拮抗作用。在保留原始分離株的前提下，對各菌株進行10代次的繼代培養后，重新測定活性，篩選出具有較強抗菌活性的7個菌株，各菌株對黃曲霉等飼料中常見霉菌的拮抗作用如表1所示，其中S24菌株對引起飼料常見的霉菌具有強烈的拮抗作用見圖1。

表1 黃曲霉拮抗菌對霉變真菌的拮抗作用

利用復合培養基對具有拮抗效果的7個菌株進行發酵，測試菌株發酵上清液對黃曲霉的抑制效果如圖2，結果顯示菌株S24發酵性能較好，發酵液抑菌活性效果見圖3，抑菌直徑達31～32毫米。

三、結論

目前，對于飼料霉變菌及其毒素的危害，研究集中在毒素脫毒技術的改進及檢測方法的優化等主要方面，隨著科技的發展，從植物源與微生物源分離活性物質對霉變菌及其毒素的防治正不斷引起人們的重視。從飼料安全的角度，利用微生物之間的拮抗作用，探索生物控制方法來預防飼料中霉菌的生長與產毒具有重要意義。本研究提供了一種以危害菌為靶標篩選有益菌的方案，可為其他篩選目標菌的研究提供基本的試驗方案，具有較好的借鑒意義。本研究以飼料中常見霉變真菌黃曲霉、煙曲霉、黑曲霉、赭曲霉等為靶標，從泰山土壤中篩選到多株對飼料中常見霉變真菌具有較強拮抗作用的菌株，其中拮抗菌S24及其發酵產生的活性物質對飼料中常見霉菌的拮抗作用最佳，后續研究發現該菌株抗菌譜廣、發酵性狀優異、遺傳穩定，產生的抗菌物質理化性質穩定，具有較好的開發前景。