空氣污染暴露對(duì)大鼠呼吸系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制研究

朱敏立，胡 美，司少艷，李月越，王瑞娟，吳 瑋

隨著燃料的應(yīng)用及工業(yè)化程度的提高，空氣污染是人類必須面對(duì)的問題，有研究報(bào)道其是造成過早死亡的主要環(huán)境因素[1]。研究顯示，空氣質(zhì)量指數(shù)與兒童鼻炎和咳嗽發(fā)生頻率增加相關(guān)[2]。空氣污染物成分十分復(fù)雜，主要有一氧化碳(CO)、氮氧化物(NOx)、臭氧(O3)、碳?xì)浠衔铩⒘蜓趸锛邦w粒物(particulate matter， PM)等。氣體污染物和顆粒污染物均可導(dǎo)致機(jī)體損傷，但損傷機(jī)制尚不明確。本研究中通過將大鼠在實(shí)時(shí)大氣環(huán)境、過濾掉空氣動(dòng)力學(xué)直徑>0.3 μm的細(xì)顆粒物的氣體環(huán)境和潔凈級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)3個(gè)月，觀察大鼠肺組織病理學(xué)變化、支氣管肺泡灌洗液中T淋巴細(xì)胞亞群及部分炎性因子的變化，探討空氣污染在呼吸系統(tǒng)反應(yīng)中可能發(fā)揮的作用及炎癥機(jī)制。

1 材料及方法

1.1試劑和主要儀器 PerCP標(biāo)記抗大鼠CD3抗體、FITC標(biāo)記抗大鼠CD4抗體、PE標(biāo)記抗大鼠CD8抗體均為eBioscience公司產(chǎn)品；炎性因子多因子檢測(cè)試劑盒及MAGPIX多功能液相芯片分析儀均為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；FACSCalibur流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品；空氣污染物動(dòng)式暴露艙為濟(jì)南巨康凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品，由中國(guó)科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.2空氣質(zhì)量數(shù)據(jù)采集 選取2016年12月1日—2017年2月28日空氣質(zhì)量數(shù)據(jù)，來自國(guó)家氣象局北京市奧體中心(距離試驗(yàn)中空氣采集點(diǎn)2 km處)氣象數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)點(diǎn)官方數(shù)據(jù)。

1.3動(dòng)物分組及空氣污染暴露方法 SPF級(jí)雄性SD大鼠27只，體質(zhì)量180～200 g，隨機(jī)分為潔凈組、大氣組、過濾組，每組9只。將潔凈組大鼠放置于SPF動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)；大氣組大鼠放置于空氣污染物動(dòng)式暴露艙，該飼養(yǎng)艙通過管路實(shí)時(shí)收集外界環(huán)境中大氣，艙內(nèi)空氣質(zhì)量等同于外界大氣環(huán)境；過濾組大鼠放置于空氣入口處放置HEPA濾膜的空氣污染物動(dòng)式暴露艙，過濾掉空氣動(dòng)力學(xué)直徑>0.3 μm的細(xì)顆粒物，其他等同于大氣組飼養(yǎng)艙。3組大鼠均給予普通飼料喂養(yǎng)，晝夜節(jié)律變化為12 h。

1.4標(biāo)本采集 于2017年3月1日結(jié)束空氣污染暴露。各組大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉后，用自制灌洗針將4 ℃生理鹽水經(jīng)右側(cè)主支氣管注入右肺組織，行支氣管肺泡灌洗，每次灌洗量為3 ml，并反復(fù)抽吸，共灌洗3次，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)。將BALF收集在無菌離心管中并置于冰上，4 ℃ 1500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀用于T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)；BALF上清凍存于-80 ℃低溫冰箱，用于炎性因子分析。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1肺組織病理學(xué)觀察：取左側(cè)肺臟下葉組織以10%多聚甲醛溶液固定，進(jìn)行肺組織病理學(xué)觀察。制備肺組織石蠟切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色后，通過光學(xué)顯微鏡觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.5.2BALF中炎性因子檢測(cè)和T淋巴細(xì)胞亞群分析：①采用液態(tài)懸浮芯片法檢測(cè)BALF中炎性因子，包括白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-13、IL-17、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。②BALF離心，細(xì)胞沉淀用100 μl含5%胎牛血清的1640懸浮，采用熒光素標(biāo)記的抗大鼠CD3+、CD4+、CD8+抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，以CD3+ T細(xì)胞設(shè)門，檢測(cè)CD4+、CD8+ T細(xì)胞的百分比，然后計(jì)算CD4+/CD8+比值。

2 結(jié)果

2.1空氣質(zhì)量數(shù)據(jù) 所有大鼠飼養(yǎng)時(shí)間為88 d，其中空氣質(zhì)量?jī)?yōu)良23 d，嚴(yán)重及重度污染41 d，輕中度污染24 d。空氣質(zhì)量指數(shù)(AQI)及PM2.5、PM10、CO、NO2、O3、SO2的含量為間隔1 h的動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)顯示，各指標(biāo)均不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)、四分位數(shù)、最小值和最大值表示。見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)期間采集大氣實(shí)時(shí)空氣質(zhì)量數(shù)據(jù)

2.2大鼠體質(zhì)量比較 3組大鼠均無意外死亡，體質(zhì)量分別為潔凈組(509.93±22.49)g、大氣組(528.50±27.47)g、過濾組(533.67±13.25)g。3組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3大鼠肺組織病理比較 潔凈組大鼠肺組織肺泡完整，無明顯肺泡融合，肺間隔無明顯增寬，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；過濾組大鼠部分肺組織出現(xiàn)肺間隔增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡融合、形成肺大泡；大氣組大鼠部分肺組織出現(xiàn)肺間隔增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡融合、形成肺大泡，程度較過濾組加重。見圖1。

圖1 不同暴露條件下3組大鼠肺組織病理變化(HE×200)

2.4大鼠BALF中T淋巴細(xì)胞水平比較 3組BALF中CD4+細(xì)胞水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與潔凈組比較，過濾組和大氣組BALF中CD8+水平升高，CD4+/CD8+水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，但大氣組和過濾組上述指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同暴露條件下3組大鼠BALF中淋巴細(xì)胞分類比較

2.5大鼠BALF中炎性因子含量比較 過濾組和大氣組BALF中IL-1β、IL-6、IL-13、IL-17、TNF-α含量均顯著高于潔凈組(P<0.01)，但過濾組和大氣組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同暴露條件下3組大鼠BALF中炎性因子水平比較

3 討論

空氣污染與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可能有多種機(jī)制參與，包括氧化應(yīng)激、炎性損傷及免疫損傷等，但具體機(jī)制尚不清楚。近年，關(guān)于細(xì)顆粒物對(duì)機(jī)體的有害影響研究很多。顆粒污染物由多種成分和灰塵構(gòu)成，表面可附著多種毒性成分，PM2.5可經(jīng)呼吸系統(tǒng)進(jìn)入血液，被認(rèn)為是對(duì)健康危害最大的空氣污染物之一。既往文獻(xiàn)報(bào)道，空氣中PM2.5濃度增加與肺功能指標(biāo)短時(shí)間異常相關(guān)，并且與肺炎及慢性氣道疾病的發(fā)病率、住院率增高相關(guān)[3-4]。

文獻(xiàn)報(bào)道，大鼠暴露于高濃度PM2.5環(huán)境中后，BALF中炎性細(xì)胞增多，IL-6、IL-10等炎性因子水平升高，TNF-α水平下降；靜脈血中CD3+細(xì)胞增加，CD4+/CD8+比值降低[5-7]。有體外試驗(yàn)證實(shí)，PM2.5可導(dǎo)致急性髓細(xì)胞系細(xì)胞TNF-α等炎性因子分泌增加[5]。本研究結(jié)果顯示，與潔凈組比較，過濾組和大氣組大鼠肺組織出現(xiàn)輕度炎性改變，可見部分肺泡融合形成肺大泡，且IL-1β、IL-6、IL-13、IL-17、TNF-α水平升高；過濾組和大氣組BALF中CD8+升高，CD4+/CD8+比值下降。與上述研究結(jié)果類似。

本研究結(jié)果顯示，過濾組與大氣組IL-1β、IL-6、IL-13、IL-17、TNF-α、CD8+、CD4+、CD4+/CD8+水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析其原因可能與本研究采用的污染環(huán)境暴露條件有關(guān)。在此次實(shí)驗(yàn)期間，大鼠飼養(yǎng)88 d，其中重度以上空氣污染時(shí)間41 d，即相對(duì)于潔凈組和過濾組，大氣組大鼠接觸高濃度PM2.5環(huán)境時(shí)間占總觀察時(shí)間的46.6%。與部分研究采用高濃度PM2.5環(huán)境暴露相比，本研究PM2.5為實(shí)時(shí)空氣中的細(xì)顆粒物濃度，低于其他采集PM2.5制成混懸液復(fù)制霧霾動(dòng)物模型的毒性。同時(shí)過濾艙的過濾膜對(duì)于直徑<0.3 μm的物質(zhì)并不能起到過濾作用。近年來，空氣動(dòng)力學(xué)直徑<0.1 μm的超細(xì)顆粒物(UFPs) 對(duì)機(jī)體的有害影響也逐漸受到重視。文獻(xiàn)報(bào)道，與同一地點(diǎn)同時(shí)采集的PM10和PM2.5相比，大氣環(huán)境中UFPs多環(huán)芳烴含量高，更容易導(dǎo)致細(xì)胞損傷[8]。UFPs不止與呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)，而且與心血管疾病密切相關(guān)[9-10]。由于UFPs顆粒細(xì)小、濃度易變、檢測(cè)難度大，故UFPs尚未納入日常監(jiān)測(cè)。

張秀川等[10]對(duì)2014年北京地區(qū)大顆粒物進(jìn)行分析，結(jié)果顯示附著在顆粒物表面的有害化學(xué)物質(zhì)苯并芘等多環(huán)芳烴與AQI呈正相關(guān)。這些物質(zhì)通過附著在顆粒物或游離狀態(tài)進(jìn)入呼吸系統(tǒng)，繼而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，對(duì)系統(tǒng)造成損傷[11]。研究顯示高濃度NO2可導(dǎo)致大鼠終末細(xì)支氣管上皮損傷和氣道纖毛破壞[12]。O3濃度增加等空氣污染可導(dǎo)致哮喘、急性呼吸道感染、肺炎、慢性阻塞性肺疾病等急診就診次數(shù)增加，因哮喘急性發(fā)作住院率也明顯升高[13]。

綜上所述，空氣污染暴露可導(dǎo)致大鼠肺組織炎癥反應(yīng)，使炎性因子和淋巴細(xì)胞分類不同程度改變，可能與IL-1β、IL-6、IL-13、IL-17、TNF-α升高和T淋巴細(xì)胞構(gòu)成改變有關(guān)。同時(shí)，導(dǎo)致空氣質(zhì)量差的不同直徑顆粒物，以及不同成分的作用機(jī)制，需要進(jìn)一步研究探討。