人誘導多能干細胞移植治療大鼠心肌梗死

毛慶 梁秀琳 龐毅恒 盧永祥

(廣西醫科大學第二附屬醫院 1心內科,廣西 南寧 530007；2神經內科)

急性心肌梗死(AMI)是致殘和致死的主要心血管疾病之一，其發病率逐年上升〔1〕。特別是心肌梗死面積較大患者的壞死心肌，在修復過程中形成不具有收縮功能的纖維性瘢痕，最終可能導致心律失常、心室功能障礙甚至梗死后充血性心力衰竭〔2〕。雖然心臟有內源性修復系統，但其再生能力有限，不足以完全替代受損心肌組織，心肌損傷幾乎不可逆轉〔3〕。臨床上常用的經皮冠狀動脈介入治療和溶栓治療雖然可以改善心肌血液供應，但不能產生功能性新生心肌細胞修復壞死心肌組織〔4〕。近年來，向心肌梗死部位注入干細胞，成為增強心肌修復能力、預防或逆轉心室重構的新策略〔5〕。

干細胞能夠分裂和分化成具有特殊功能的各種成熟細胞類型〔6〕。干細胞分為胚胎干細胞，成體干細胞和多能干細胞〔7〕。體內外實驗研究發現，胚胎干細胞和多種來源的成體干細胞被成功誘導分化為有功能的心肌細胞，在植入部位和原有心肌整合，改善了心臟功能〔8～10〕。誘導多能干細胞是近年來從成體干細胞中制備獲得的多能干細胞，有著與胚胎干細胞相似的多向分化潛能，可分化為任意類型的細胞，卻沒有免疫原性和倫理學爭議〔11〕。國內外學者關于誘導多能干細胞向心肌細胞分化的體外研究顯示其心肌定向分化效率不斷提高；移植治療心肌梗死的體內研究則是將誘導性多能干細胞先在體外誘導分化為心肌細胞再移植至心肌梗死動物模型的心臟內〔12〕。Ishida等〔13〕研究表明，來源于人誘導多能干細胞的心肌細胞移植治療豬心肌梗死在恢復心臟功能和耗氧量方面優于來源于成體干細胞的心肌細胞。Templin等〔14〕應用計算機斷層掃描對移植入大鼠心肌梗死模型中的人誘導多能干細胞在進行跟蹤，結果顯示在移植后的15 w內細胞的存活、植入和分布達到了預期效果。本研究建立心肌梗死大鼠模型，將人誘導多能干細胞體外誘導分化為心肌細胞進行移植的同時，也將未經誘導分化的人誘導多能干細胞直接移植至心肌損傷部位，比較兩種細胞對心肌細胞損傷治療的效果。

1 材料和方法

1.1材料 實驗動物：12周齡SD大鼠，雌性，SPF級，體重(230±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2017-0033。細胞株：人誘導多能干細胞和CardioEasy?人心肌細胞購于北京賽貝生物技術有限公司。

主要儀器和試劑：PSCeasy?人多潛能干細胞培養基、PSCeasy?人多潛能干細胞鋪底工作液、CardioEasy?心肌復蘇培養基、CardioEasy?人心肌細胞維持培養基、CaridoEasy?人心肌細胞消化液、PSCeasy?人多潛能干細胞消化液和PSCeasy?人多潛能干細胞復蘇培養基購于北京賽貝生物技術有限公司；CM-DiI 活細胞染色劑購于美國Invitrogen公司；Masson三色染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；水合氯醛和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購于Sigma公司；兔抗大鼠CD31多克隆抗體、羊抗鼠IgG3-FITC購于美國Santa Cruz公司；CO2培養箱、超凈工作臺購于美國Thermo公司；光學顯微鏡和熒光顯微鏡購于德國Leica公司。

1.2實驗方法

1.2.1SD大鼠心肌梗死模型的制備〔15〕40只SD大鼠禁食12 h，用氯胺酮(75 mg/kg體重)腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位，氣管插管連接呼吸機輔助通氣，常規備皮、消毒、鋪巾，自大鼠左胸第四肋間做橫切口打開胸腔，推開左肺，撕開心包膜，充分暴露左冠狀動脈，自左心耳下方2 cm處進針，用8-0縫合線縫扎冠狀動脈左前降支，待結扎下方心肌大面積變白和室壁運動減弱，胸前放置引流軟管，逐層縫合關胸。造模成功的標志〔16〕：造模72 h后進行以下檢查，①心電圖結果顯示ST段抬高，Q波寬而深，T波倒置；②心臟彩超結果顯示左室射血分數和左室縮短分數降低。 造模過程中2只大鼠死亡，2只大鼠未達到造模成功標準，其余36只大鼠造模成功。另取12只SD大鼠只開胸、不結扎冠狀動脈作為假手術組。

1.2.2細胞培養〔17〕已經鑒定的人誘導多能干細胞用人多潛能干細胞復蘇培養基復蘇，用人多潛能干細胞鋪底工作液涂在培養皿底部，將人誘導多能干細胞接種于培養皿內，用人多潛能干細胞培養基在37℃、5%CO2培養箱內培養，隔日換液1次，待細胞生長融合達培養皿底部85%后用人多潛能干細胞消化液消化細胞進行傳代；用心肌復蘇培養基復蘇已經鑒定的人心肌細胞，將人心肌細胞接種于培養皿中用人心肌細胞維持培養基在37℃、5%CO2培養箱內培養，每日換液1次，待細胞生長融合達培養皿底部85%后用人心肌細胞消化液消化細胞進行傳代。將傳至第3代的人誘導多能干細胞和人心肌細胞用移植。

1.2.3實驗分組與細胞移植 將造模成功的36只SD大鼠隨機分為模型組、心肌細胞組和干細胞組，每組12只。①模型組：不予治療；②心肌細胞組：用第3代人心肌細胞移植；③干細胞組：用第3代的人誘導多能干細胞移植；④另取12只作為假手術組：不予治療。細胞移植方法：在移植前24 h，用CM-DiI 活細胞染色劑分別標記人誘導多能干細胞和心肌細胞，PBS洗滌細胞，用PBS將人誘導多能干細胞和心肌細胞制成濃度為1×106/ml的細胞懸液，每只大鼠經頸靜脈注射200 μl細胞懸液。

1.2.4冰凍切片觀察人誘導多能干細胞和心肌細胞的歸巢〔18〕移植2 w后，各組隨機選取3只大鼠，麻醉后快速取出心臟，切除結扎點水平以上的心房和部分心室，將剩余部分放入-80℃冰箱，快速冷凍30 min，用冰凍切片機連續切片，制成厚度為制作8 μm的冰凍切片，4%多聚甲醛固定1 h，DAPI染核5 min，放淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下用560 nm波長激光器激發綠色熒光、用405 nm波長激光器激發藍色熒光，觀察CM-DiI標記的呈綠色熒光的人誘導多能干細胞和人心肌細胞在心肌梗死部位的歸巢情況。每張切片選取有綠色熒光的5個低倍視野，用Image Pro6.0軟件測量視野中呈綠色熒光細胞的個數，計算平均值比較細胞歸巢情況。

1.2.5免疫熒光染色檢測細胞定植部位血管新生情況〔19〕移植4 w后，各組隨機選取3只大鼠，麻醉后快速取出心臟，切除結扎點水平以上的心房和部分心室，將剩余部分心肌放入4%多聚甲醛中固定24 h，經脫水和透明后常規石蠟包埋，石蠟切片機連續切片。將制成的石蠟切片，PBS漂洗、烤片、脫蠟、水合，用10%山羊血清室溫封閉1 h，滴加兔抗大鼠CD31多克隆抗體(工作濃度1∶50)，4℃避光孵育12 h，次日去除抗體溶液，滴加羊抗鼠IgG3-FITC避光孵育45 min，抗淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。CD31陽性血管內皮細胞發紅色熒光，為了不影響CD31陽性細胞觀察未用DAPI染核。每張切片選取有紅色熒光的5個低倍視野，用Image Pro6.0軟件測量視野中呈紅色熒光細胞的平均光密度值，計算平均值比較血管新生情況。

1.2.6Masson染色觀察心肌纖維化情況〔20〕移植4 w后，取1.2.5中制作的石蠟切片，脫蠟、梯度乙醇水合、流水沖洗，1%地伊紅染液染色1 h，蒸餾水沖洗2 min，蘇木素染色5 min，蒸餾水沖洗2 min，麗春紅染液染色10 min，0.2%冰醋酸浸泡3 min，1%磷酸鋁溶液分化1 min，2%亮綠染液染色1 min，0.2%冰醋酸浸泡3 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察：膠原纖維被染成藍色、心肌纖維染成粉紅色。用Image Pro6.0軟件測量切片橫截面中心肌纖維化面積和心肌梗死面積，根據公式：心肌纖維化面積百分比(%)=心肌纖維化面積/心肌梗死面積×100%。

1.2.7心臟超聲檢測心功能變化情況〔22〕各組隨機選取3只大鼠，在移植4 w后，用心臟超聲診斷儀檢測各組大鼠心功能各項參數：左室收縮末期內徑、左室舒張末期內徑和左室射血分數，連續檢測5個心動周期，取平均值進行比較。

1.3觀察指標 ①移植細胞歸巢情況；②血管再生情況；③心肌纖維化情況；④心功能各項指標。

1.4統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行方差分析，LSD檢驗，t檢驗。

2 結 果

2.1各組移植細胞的歸巢情況比較 假手術組和模型組心肌梗死區域和非梗死區域未見綠色熒光，心肌細胞組和干細胞組心肌梗死區域可見點狀綠色熒光散在分布，見圖1，心肌細胞組歸巢細胞數量高于干細胞組(62.21個 vs 46.32個，P<0.05)。

圖1 各組心肌細胞冰凍切片的熒光顯微鏡觀察結果(×400)

2.2各組血管再生情況比較 假手術組心肌纖維間可見大量呈紅色熒光的CD31陽性內皮細胞聚集成血管輪廓，模型組在梗死區域偶見紅色熒光的CD31陽性內皮細胞，心肌細胞組在梗死區域可見呈紅色熒光的CD31陽性內皮細胞散在分布，干細胞組在梗死區域可見較多呈紅色熒光的CD31陽性內皮細胞成團分布，見圖2。假手術組CD31陽性細胞的平均光密度值(0.096)明顯高于模型組、心肌細胞組和干細胞組(0.026、0.029、0.061，P<0.01)；干細胞組CD31陽性細胞的平均光密度值明顯高于模型組和心肌細胞組(P<0.01)；心肌細胞組CD31陽性細胞的平均光密度值高于模型組，但差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2 各組血管再生免疫熒光染色結果(×400)

2.3各組心功能比較 移植4 w后，模型組、心肌細胞組、干細胞組左室收縮末期內徑和左室舒張末期內徑明顯高于假手術組，而左室射血分數明顯低于假手術組(P<0.05)；心肌細胞組、干細胞組左室收縮末期內徑和左室舒張末期內徑明顯低于模型組，而左室射血分數明顯高于模型組(P<0.05)；干細胞組左室收縮末期內徑和左室舒張末期內徑明顯低于心肌細胞組，而左室射血分數明顯高于心肌細胞組(P<0.05)。見表1。

表1 各組心功能比較

2.4各組心肌纖維化情況比較 見圖3。假手術組心肌組織結構正常，排列整齊的心肌細胞被染成紅色，未見心肌組織纖維化；模型組心肌梗死區域可見大量藍色膠原纖維取代了正常心肌結構；心肌細胞組心肌梗死區域可見大量藍色膠原纖維填充；干細胞組心肌梗死區域可見藍色膠原纖維散在分布；干細胞組心肌纖維化面積(30.6%)明顯小于模型組和心肌細胞組(52.3%、41.2%，P<0.01)。

圖3 各組心肌纖維化Masson染色結果(×400)

3 討 論

誘導多能干細胞和間充質干細胞均來源于自體細胞，但誘導多能干細胞的分化效率高于間充質干細胞，為心肌梗死的細胞移植等再生醫學提供了理想的種子細胞〔13，21〕。Ye 等〔22〕在體外將人源誘導多能干細胞誘導分化為心肌細胞后注射移植入心肌梗死豬模型心肌梗死邊緣區域，結果顯示移植的心肌細胞整合到了原有的心肌組織中，縮小了心肌梗死的面積，改善了心室功能。Zhang等〔23〕將人心肌成纖維細胞重編程為誘導多能干細胞并誘導分化為心肌細胞移植到心肌梗死模型小鼠心肌梗死區域4 w后，心肌梗死區域凋亡細胞減少，左室心肌收縮力增強。以上研究表明，人誘導多能干細胞來源的心肌細胞直接注射到動物模型心肌梗死邊緣能促進心肌損傷后的修復。但誘導多能干細胞向心肌細胞的分化效率一直制約其應用〔24，25〕。祝因蘇等〔26〕直接將誘導多能干細胞注射移植到心肌梗死模型豬的心肌梗死損傷部位，縮小了梗死面積并改善了心肌收縮功能，結果說明直接移植誘導多能干細胞同樣能減輕心肌損傷，促進心肌功能的好轉，未見明顯的免疫排斥反應。以上研究都是通過干細胞心內原位移植，模型動物需要接受開胸手術，較靜脈移植的損傷大。本研究結果表明人誘導多能干細胞可歸巢到心肌梗死邊緣區域，縮小了心肌梗死面積，改善了左室心肌功能。同時，本研究結果顯示，心肌功能和纖維化改善方面心肌細胞治療優于人誘導多能干細胞治療，在血管再生方面人誘導多能干細胞優于心肌細胞。

研究發現，通過靜脈移植干細胞修復心肌損傷的過程中，干細胞不僅要經血液定向遷移歸巢到心臟部位，還需要黏附于心肌組織內的毛細血管內皮細胞，通過變形運動穿過內皮間隙直接與損傷心肌組織接觸〔27，28〕。CM-DiI熒光染料與細胞膜中的磷脂結合來標記細胞，發出的紅色熒光強而穩定，存在時間長〔29〕。結果顯示，兩種細胞均歸巢到心肌梗死損傷部位，人誘導多能干細胞主要分布在梗死區域邊緣，心肌細胞則出現在損傷心肌組織內；從數量上比較發現心肌細胞歸巢數量高于人誘導多能干細胞，其可能原因是心肌細胞與心肌組織的相容性優于人誘導多能干細胞，心肌細胞更容易定向遷移到心肌損傷部位發揮作用。Yu等〔30〕和Pinho-Ribeiro等〔31〕研究均證實經靜脈移植間充質干細胞治療心肌梗死時僅有約2%的干細胞歸巢，最后只1%的干細胞定植。既往研究表明，干細胞移植治療心肌梗死的主要機制是通過旁分泌作用促進血管新生和抑制心肌纖維化，而心肌細胞再生作用較小〔32～34〕。本研究提示人誘導多能干細胞可能通過旁分泌作用促進組織中血管的再生；心肌細胞組血管再生情況與模型組沒有明顯差異的可能原因是心肌細胞不具有旁分泌功能。本研究提示人誘導多能干細胞可能通過抑制心肌纖維化減小心肌梗死面積。以上結果與趙啟明等〔35〕的薈萃研究一致，干細胞通過旁分泌多種細胞因子促進血管新生和增加血管密度，改善損傷局部的微環境，抑制膠原纖維形成，改善心肌的組織結構和提高心肌收縮能力。本研究結果與上述研究結果一致。