新一代腫瘤標志物循環腫瘤細胞分型在宮頸癌診斷中的臨床意義

張俊華，袁高亮，紀麗偉

(上海交通大學醫學院附屬蘇州九龍醫院婦產科，江蘇 蘇州 215000)

宮頸癌(cervical cancer，CC)是女性常見的惡性腫瘤之一[1]。近年來，CC的發病率逐年上升，且呈年輕化趨勢[2-3]。CC的復發轉移是造成死亡的重要原因之一。在腫瘤轉移過程中，癌細胞從原發灶分離后到達血液，成為循環腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)，可靶向遠處器官并有助于繼發性腫瘤的發生[4]。與計算機斷層和正電子發射斷層掃描相比，CTC檢測有助于更早、更有效地診斷腫瘤的復發和轉移[5]。循環腫瘤微栓(circulating tumor microemboli,CTM)即兩個或以上CTC集群，有利于細胞之間的生物信息傳遞，更容易在血流剪切壓力下存活[6]，導致腫瘤復發或遠端轉移。目前關于CTC/CTM在CC癌患者中臨床意義的研究甚少，本文旨在探究CTC/CTM在CC癌患者中的分布及與臨床特征和血清腫瘤標志物表達水平之間的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2016年4月—2020年4月上海交通大學醫學院附屬蘇州九龍醫院收治的擬進行手術的初治患者32例，術后病理診斷為宮頸癌。納入標準：未經過放療、化療和激素治療。排除第二原發腫瘤患者、妊娠和哺乳期患者、合并自身免疫疾病患者、嚴重肝腎不全患者。年齡28～65歲，平均(48.41±5.51)歲；鱗癌25例，腺癌6例，其他1例；術后腫瘤病理分期及分級分別參照WHO分級標準和國際婦產科聯盟推薦標準[7-8]：Ⅰ期6例、Ⅱ期11例、Ⅲ期6例、Ⅳ期9例。

本研究經醫院醫學倫理委員會批準通過，所有受試者均自愿簽訂知情同意書。

1.2方法

1.2.1病理資料 收集32例患者的年齡、病理類型、臨床分期和病理分級、淋巴結轉移情況。同時記錄采血時1周內血清CA125、CA199和SCC-Ag的表達水平。

1.2.2CTC和CTM檢測方法 CTC檢測試劑盒購于江蘇萊爾生物醫藥科技有限公司，其試劑盒具體包括人外周血白細胞去除試劑盒(抗人CD45熒光免疫抗體染色試劑，抗人EpCAM的熒光免疫抗體染色試劑)和8號染色體著絲粒熒光原位雜交樣品處理試劑盒。

采集肘靜脈血4 mL于ACD抗凝的黃色采血管中，避光低溫保存，24 h內檢測。應用紅細胞裂解法除去紅細胞，磁珠抗體除去白細胞，應用免疫熒光技術染色腫瘤標志物，再利用熒光原位雜交技術標記8號染色體。上述實驗操作完成后在熒光顯微鏡下觀察。先將顯微物鏡鏡頭調至×10，然后按照讀片規則依次讀片，在不同視野過程中發現CD45陰性細胞，確定8號染色體的數目后，再依次自動調至藍光、綠光下鏡下觀察。CTC的判讀標準為EpCAM+/CD45-/DAPI+/CEP8≥2或者EpCAM-/CD45-/DAPI+/CEP8≥2；CTM的判讀標準為單個循環腫瘤細胞數量≥2個CTC聚集成的細胞團。

1.2.3血清標志物CA125、CA199和SCC-Ag檢測方法 采集空腹肘靜脈血3 mL，靜置離心后分上層血清，應用電化學發光免疫分析技術檢測CA125、CA199和SCC-Ag的表達水平(羅氏Cobas e601型全自動電化學發光免疫分析系統及配套試劑)。血清標志物檢測的判定結果參考配套試劑的說明書，CA125≥35 kU/L為陽性，CA199≥35 kU/L為陽性，SCC-Ag≥1.5 μg/L為陽性。

1.3統計學方法 應用SPSS 26.0統計軟件分析數據。計數資料比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Pearson檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1宮頸癌患者外周血中CTC/CTM各亞型的分布情況 收集32例宮頸癌患者的外周血，熒光顯微鏡下觀察CTC/CTM(圖1)。32例檢出CTC陽性29例，陽性檢出率為90.63%；檢出CTM陽性9例，陽性檢出率為28.13%。

29例CTC陽性宮頸癌患者中檢出三倍體CTC 19例，三倍體陽性檢出率為59.40%，檢出范圍為0～7個/4 mL，檢出個數為(1.50±1.90)個；檢出四倍體CTC 16例，四倍體陽性檢出率為55.10%，檢出范圍為0～5個/4 mL，檢出個數為(0.97±1.31)個；檢出多倍體CTC 22例，多倍體陽性檢出率為68.80%，檢出范圍為0～7個/4 mL，檢出個數為(1.78±1.93)個。

圖1 宮頸癌患者外周血中的CTC/CTM(×100)A.EpCAM-/CD45-/DAPI+/8號染色體為三體的CTC;B.EpCAM-/CD45-/DAPI+/8號染色體為四體的CTC;C.EpCAM-/CD45-/DAPI+/8號染色體≥五倍體的CTC;D.EpCAM+/CD45-/DAPI+/8號染色體≥五倍體的CTC;E.EpCAM+的CTM;F.EpCAM-的CTMFigure1 CTC/CTMinperipheralbloodofcervicalcancerpatients(×100)

2.2宮頸癌患者外周血中CTC/CTM計數基線與臨床不良病理特征的關系 不同淋巴結轉移情況宮頸癌患者CTC陽性率差異有統計學意義(P<0.05)，不同年齡、病理類型和臨床分期宮頸癌患者CTC陽性率差異無統計學意義(P>0.05)。不同臨床分期和淋巴結轉移情況宮頸癌患者CTM陽性率差異有統計學意義(P<0.05)，不同年齡、病理類型宮頸癌患者CTM陽性率差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。各個分期的初治宮頸癌患者和有淋巴結轉移的宮頸癌患者的外周血中均可以檢測出CTC，Ⅲ期和Ⅳ期患者 CTC陽性檢出率略高于Ⅰ期和Ⅱ期患者。

表1 不同病理特征宮頸癌患者外周血中CTC、CTM陽性率比較

2.3宮頸癌患者外周血中血清標志物CA125、CA199和SCC-Ag的表達水平分布 分析初治32例宮頸癌患者檢測時間點1周內的血清腫瘤標志物，檢出CA125陽性28例，陽性檢出率為87.5%，檢出水平范圍為25.9～537.7 kU/L，平均(149.9±131.6)kU/L；檢出CA199陽性28例，陽性檢出率為87.5%，檢出水平范圍為16.4～190.4 kU/L，平均(70.9±37.1)kU/L；檢出SCC-Ag陽性24例，陽性檢出率為75.0%，檢出水平范圍為0.3～10.2 μg/L，平均(4.2±3.0)μg/L。

2.4宮頸癌患者CTC、CTM與血清標志物的相關性分析 CTC、CTM與CA125、CA199和SCC-Ag均無相關性(P>0.05)。見表2。

表2 宮頸癌患者CTC、CTM與血清標志物的相關性分析

3 討 論

CC發生在子宮頸的上皮，特別是在子宮頸和子宮頸的鱗狀小柱交界處，這是一個連續的代謝活動部位[9]。近年來，CC的診斷和治療取得了重大進展，但總體5年生存率仍然很低[9]。目前，宮頸癌復發轉移的診斷主要依賴于醫學影像，血清腫瘤標志物,病理組織等手段。CTC/CTM作為一種新興的腫瘤分子標記物，有助于腫瘤的個體化治療，為臨床早期診斷、療效和預后評估提供指導。外周血中CTC/CTM檢測被認為是實體瘤的“液體活組織檢查”，因為其容易形成，發生率高，創傷小[10]。本研究結果表明，CTC陽性檢出率為90.63%，在其他研究報道的CTC檢測率66.6%～98.1%范圍內[11-12]；CTM陽性檢出率為28.13%。此外，在29例CTC陽性的宮頸癌患者中，三倍體CTC陽性檢出率為59.4%；四倍體CTC陽性檢出率為55.1%；多倍體CTC陽性檢出率為68.8%。本研究結果顯示，CC患者外周血CTC陽性率較高，提示術前檢測CTC可作為一種新的指標，實時反映CC患者的微轉移狀態和復發風險，反過來又可以在真正復發之前提供治療時間。

越來越多的證據證明，CTC/CTM是診斷、預后和藥理學目的的臨床標志物。因此，CTC/CTM的檢測和表征已成為世界范圍內的研究熱點。CTC/CTM在轉移性乳腺癌、結腸癌和前列腺癌中的預后意義已被廣泛報道。此外，外周血CTC/CTM作為一種非侵入性指標，將使臨床醫生能夠為宮頸癌患者設計個體化的術后輔助治療，以減少復發和轉移，提高腫瘤患者的生存率和生活質量[13-15]。CTC作為癌癥的預后標志物具有良好的應用前景。早期乳腺癌患者每30 mL血液中CTC≥5的預后較差[16]。非轉移性結直腸癌患者外周血CTC≥1/7.5 mL時，復發轉移風險大，預后差[17]。在各種癌癥中，CTC計數與患者年齡、疾病階段、組織學分化、腫瘤大小和病理類型之間的相關性是不同的。本研究觀察了CTC/CTM陽性率與臨床病理特征之間的關系。CTC陽性檢出率與淋巴結轉移呈正相關，與年齡、病理類型和臨床分期均無相關。CTM陽性檢出率與臨床分期和淋巴結轉移呈正相關，與年齡、病理類型無相關。此外，各個分期的初治CC患者和有淋巴結轉移的CC患者外周血中均可以檢測出CTC，Ⅲ期和Ⅳ期患者CTC陽性檢出率略高于Ⅰ期和Ⅱ期患者。這些結果表明，外周血中CTC/CTM含量較高的早期CC患者也有較高的風險出現盆腔淋巴結轉移[18]，與CC的惡性程度密切相關，是不良預后的獨立預測因素之一。

腫瘤標志物檢測為早期惡性腫瘤的術前預測提供了一種新的解決方案，已從惡性腫瘤患者的血清中檢測到一些與腫瘤相關的抗原，且與疾病的臨床分期等病理特征有關[19]。與婦科癌癥密切相關的惡性腫瘤血清標志物(包括SCC-Ag、AFP、CA153、CEA、CA125和CA199)對評估治療前、評估療效和患者預后具有重要價值[20]。SCC-Ag和CA125是目前CC檢測的常用標記物[21]。王若琪等[22]研究發現，CA199在CC患者血清中的陽性率升高。本研究收集了CC患者的臨床病理數據，并分析了其與術前血清腫瘤標志物的關系，以尋找可預測的危險因素。CA125、CA199、SCC-Ag陽性檢出率分別為87.5%、87.5%和75.0%。此外，將CTC/CTM與CA125、CA199和SCC-Ag進行相關分析，未發現CTC/CTM基線計數與3種標記物具有明顯相關性。

本研究納入的目標樣本數量偏少，后續研究將擴大樣本量作進一步的驗證分析，CTC/CTM與腫瘤標志物的臨床價值還需要通過大規模多中心研究來深入探究其具體作用機制。

綜上所述，同時檢測CTC/CTM和和血清腫瘤標志物有助于CC微轉移的早期診斷和疾病狀態的評估，具有很高的臨床應用價值。隨著CTC/CTM研究的不斷深入，可作為CC精準治療的臨床指標。