高糖高脂飼料對草魚TNF-α和TRAF1/TRAF2mRNA表達的影響

林夢君，賈申宗，余維鵬，張文雅，盧榮華＊

（河南師范大學水產學院，河南新鄉 453007）

草魚（Ctenopharyngodon idella）是我國淡水養殖產量最大的經濟魚類，具有生長速度快、肉質鮮美等優點，深受消費者的喜愛。但在集約化養殖過程中，飼料中脂肪和碳水化合物含量過高，營養組成不平衡，導致草魚體內能量代謝平衡被打破[1]，經常出現脂肪異位蓄積、抗應激能力下降等問題。因此，如何提高草魚對糖脂的利用能力、改善體內脂質蓄積以及提高魚體免疫力已顯得非常迫切。

腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor α,TNFα）是一種細胞因子。研究發現，TNF-α可以結合其受體（TNFR），通過招募腫瘤壞死因子受體相關因子（Tumor necrosis factor receptor-associated factor,TRAFS）家族分子（如TRAF1、TRAF2）調節細胞的增殖、凋亡、免疫應答和炎癥反應，進而調控機體的許多生物過程[2]。在青石斑魚（Epinephelus awoara）、金鯧魚（Trachinotus ovatus）的研究中發現，過表達TRAF2可促進神經壞死病毒（RGNNV）的復制過程[3]。對草魚的研究發現，在草魚頭腎中TNF-α可上調TRAF1和TRAF2的 表 達[4]，說 明TNF-α、TRAF1和TRAF2在機體免疫中發揮重要作用。

本研究采用高糖高脂飼料飼喂草魚，飼養實驗結束后檢測草魚肝臟、肌肉和脂肪組織中TNF-α、TRAF1和TRAF2的表達變化，研究結果可為進一步探討三種基因在草魚脂肪蓄積及營養調控中的分子機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

RNA提取試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購自TaKaRa公司（大連），本實驗引物合成由Invitrogen基因公司提供。

1.2 高糖高脂飼料對草魚肝臟組織脂肪蓄積的影響

選取平均初始體重39.98 ±0.84g的草魚180尾，隨機分為2組：對照組和高糖高脂飼料組，每組3個重復，每個重復30尾魚，實驗飼料配方及營養組成與本課題組已發表的文獻一致[5]。在河南師范大學水產學院循環水養殖系統中暫養兩周，養殖桶容量為200L，水溫23～26℃，溶解氧5.0mg/L以上，水交換量1L/min，氨基氮＜0.01mg/L，光照周期為12L:12D。在正式實驗前，先將草魚用對照組飼料馴化一周，每天8:30、13:00和17:30飼喂3次，正式養殖65d。養殖實驗結束后，每桶取6尾魚的肝臟于4%多聚甲醛中固定、石蠟包埋、切片、HE染色、封片、電子顯微鏡下觀察肝臟組織病理變化。

1.3 高糖高脂飼料對草魚TNF-α、TRAF1及TRAF2基因表達的影響

養殖實驗結束后，每桶取3尾草魚，將草魚麻醉后立即于無菌條件下解剖分離脂肪、肝臟和肌肉組織，液氮速凍后-80℃保存備用。使用qRT-PCR技術，檢 測 脂 肪、肝 臟 和 肌 肉 中TNF-α、TRAF1和TRAF2的相對表達量。

1.4 實時熒光定量PCR

表1 實時熒光定量引物序列

1.5 統計分析

采用SPSS20.0 統計分析軟件對數據進行獨立樣本T檢驗分析。不同小寫字母表示具有顯著性差異（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 草魚肝臟組織HE染色

由圖1可見，與對照組（圖1A）相比，高糖高脂飼料組的草魚肝臟細胞空泡化嚴重，細胞核明顯移位，且出現大量大的脂滴（圖1B）。

圖1 高糖高脂飼料飼喂對草魚肝臟組織脂肪蓄積的影響（HE，×100）

2.2 高糖高脂飼料對草魚TNF-α、TRAF1和TRAF2基因表達的影響

采 用qRT-PCR技 術 檢 測TNF-α、TRAF1和TRAF2基因在肝臟、脂肪和肌肉組織中的表達量（圖2，圖3，圖4）。結果顯示，與對照組相比，高糖高脂飼料可以顯著降低草魚肌肉組織中TNF-α、TRAF1和TRAF2的表達（P＜0.05），但三個基因在脂肪組織中均顯著升高（P＜0.05），在肝臟組織中僅TRAF1的表達量顯著升高（P＜0.05），TNF-α和TRAF2的表達量均無顯著性變化（P＞0.05）。

圖2 TNF-α在草魚不同組織中的表達

圖3 TRAF1在草魚不同組織中的表達

圖4 TRAF2在草魚不同組織中的表達

3 討論

本研究中，從肝臟組織學形態結果來看，高糖高脂組的草魚肝細胞中脂滴明顯增多，甚至出現了炎性細胞浸潤，這與斑馬魚[7]中的研究結果類似。

眾所周知，脂肪組織可以分泌多種細胞因子，TNF-α就是脂肪組織產生的一種多效應細胞因子。在本研究中，與對照組相比，高糖高脂可誘導草魚脂肪組織中TNF-α、TRAF1及TRAF2的表達增加，說明TNF-α、TRAF1和TRAF2可在脂肪組織中表達并分泌，導致脂肪組織炎癥的發生，并可能引起胰島素抵抗，進而誘發多種代謝性疾病[8]。姜志浩等[9]研究發現，與正常日糧相比，高脂日糧飼喂的大鼠脂肪組織中TNF-α基因mRNA表達水平均顯著上調，誘導脂肪組織中炎癥的發生，與本研究結果一致。

肝臟是魚類糖脂代謝的重要器官，對魚體內糖脂代謝的平衡至關重要。本研究中發現高糖高脂飼料可引起草魚肝臟中TRAF1的含量顯著升高且肝臟脂肪過量蓄積，唐祝奇[10]研究也發現，TRAF1在胰島素抵抗的小鼠肝臟組織中明顯升高，敲低TRAF1的表達后可減輕高脂誘導的細胞內脂質蓄積。Chen等[11]發現在高脂條件下，肝細胞特異性缺失TRAF2不會改變肝臟炎癥和胰島素信號轉導，但可減輕飲食誘導的高血糖，本實驗也發現高糖高脂飼料飼喂后肝臟中TRAF2的表達未發生變化，提示我們可能是TRAF1而不是TRAF2在肝臟中發揮重要的營養調節作用。周嫚[12]研究發現，高脂飼喂可導致團頭魴肝臟中脂肪含量增加，TNF-α表達量顯著增加，推測TNFα可能通過調節脂質合成和脂肪酸的β氧化來參與調控機體脂質代謝穩態。本研究顯示高糖高脂并沒有引起肝臟中TNF-α和TRAF2的含量發生變化，可能原因是在草魚肝臟組織中，是TRAF1作為炎癥通路的主要轉導蛋白通過靶向某一信號轉導因子進而導致肝臟脂肪變性和炎癥發生，但具體機制需要進一步研究驗證。

本研究也檢測了草魚肌肉組織中TNF-α、TRAF1和TRAF2的表達變化，發現高糖高脂組這三個基因的表達均顯著低于對照組，這可能是因為脂肪細胞是分泌TNF-α的主要組織，TNF-α可以直接作用于脂肪組織，而TNF-α可能通過作用于脂肪細胞后產生的某些物質間接作用于肌肉組織，以發揮不同的功能，具體作用機制仍需要深入研究。

4 結論

本實驗發現高糖高脂飼料可引起草魚肝臟脂肪過度蓄積，且對草魚TNF-α、TRAF1和TRAF2基因在不同組織中的mRNA表達水平影響不同，而這些組織也是魚類脂肪沉積及能量代謝的主要部位，提示TNF-α、TRAF1與TRAF2可能在高糖高脂誘導的脂肪沉積和炎癥中發揮不同的作用，這為進一步探討這三個基因對高能物質的響應機制提供了一定的理論基礎。