宏基因組測序法研究管材對生物膜致病菌的影響

2021-11-02 04:22:44彭宏熙陳環宇柳景青

哈爾濱工業大學學報 2021年11期

李藝，彭宏熙，陳環宇，柳景青

(1.浙江大學建筑工程學院，杭州 310058； 2.中水珠江規劃勘測設計有限公司市政與環境設計所,廣州 510610；3.浙江大學濱海產業技術研究院，天津 300301)

雖然水廠的出廠水是以《生活飲用水衛生標準》(GB 5749—2006)作為標準，但是飲用水從水廠到用戶之間還需要經過長距離的供水管網系統，供水管道生物膜會引起大量致病菌和致病菌的滋生[1-2]，生物膜的脫落會惡化水質，最終影響用戶端的用水水質。最近的流行病學報告指出，供水管道系統是疾病暴發的重要來源[3]。因此，當供水管道生物膜中存在致病菌時，人體接觸飲用水會導致健康風險。

致病菌在供水管道生物膜中廣泛存在。Wang等[4]在模擬供水系統(simulated distribution system, SDS)生物膜中發現了軍團菌屬(Legionellaspp.)、分枝桿菌屬(Mycobacteriumspp.)、假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)、棘阿米巴屬(Acanthamoebaspp.)，還發現了芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)。Azevedo等[5]在實際管道生物膜中分離出了幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)。供水管道生物膜的生長與許多因素相關，如管材[6]、有機物濃度[7]、消毒劑[8]、水力停留時間[9]，其中，管道材料被認為是影響生物膜中致病菌生長的重要因素。Wang等[10-11]在SDS中發現管道材料是控制飲用水微生物群落的主要因素，也影響特定致病菌的分布，相較PVC管道，水泥管或鐵管更利于水中分枝桿菌生長，同時，水泥管比鐵管和PVC管道更利于水中銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)生長。Proctor等[11]發現銅管相對于交聯聚乙烯(PEX)抑制嗜肺軍團菌和軍團菌的生長；Ren等[12]利用培養的方法發現，灰口鑄鐵管比DCIP和SSCP有更低相對豐度，含有潛在致病菌屬的相對豐度最低。因為很難從實際供水管道中獲得生物膜樣品，以往研究通常使用反應器和模擬管道[13]，模擬條件無法準確代表在復雜環境中運行的實際供水管道細菌群落的特征[14]。

16S rRNA基因擴增子測序已經廣泛運用于檢測飲用水管網[15]、污水[16]、活性污泥、河水[17]、海洋[18]等環境中的潛在致病菌屬。在飲用水領域中，有大量研究利用16S rRNA方法研究管材[4,19-20]、消毒劑、水齡[4,10]、空間位置[15,21]等對供水管道生物膜微生物群落結構和潛在致病菌屬群落的影響。然而，由于16S rRNA基因測序相對較差的分辨率，無法精確到細菌的種水平，而大多潛在致病菌屬包含許多非致病的菌種，16S rRNA基因測序可能會高估致病菌的相對豐度，也會忽略一些稀有致病菌[22]；與16S rRNA擴增子測序相比，鳥槍宏基因組測序可以全面概述各種環境中的微生物群落[23-24]和功能基因[25-27]，并已被利用在飲用水系統中檢測致病菌[26]。

在華東某城市的供水管道中試平臺收集球墨鑄鐵管(DCIP)、高密度聚乙烯管(HDPE)、鍍鋅鋼管(GSP)、不銹鋼復合管(SSCP)和鋼管(SP)管道中的生物膜，利用宏基因組測序，以實際供水管道微生物膜為研究對象，比較不同管道材料中的致病菌群落差異。本研究為飲用水供水管道生物膜中的細菌致病菌分布提供了新的見解，為供水管道管材與生物膜致病菌分布的關聯性解析提供依據。

1 實驗

1.1 供水管道生物膜的中試平臺設計

以中國東部某城市SX的供水管網系統為研究對象。該城市供水水源為水庫水，屬于Ⅱ類水，經過混凝—沉淀—砂濾—氯化(氯氣)工藝處理后進入供水管網。中試平臺建立在管網末端，距離水廠約22 km，該中試平臺于2009年6月建成并投入使用。如圖1所示，該平臺內布置5組并聯管線，每組管線由長0.5 m的管段串聯而成，管道內徑分為DN80和DN150兩種。DCIP、GSP、SSCP和SP管徑DN80，HDPE管徑DN150。中試平臺與實際管網水相連，進水由實際管網接入，出水排入下游實際管網。

圖1 供水管網中試平臺

1.2 采樣管道的信息

2016年7月與2017年7月在該中試平臺進行生物膜采樣，共采集13個生物膜樣本。采樣管道基本信息見表1。

表1 采樣管道基本信息

1.3 生物膜現場采集與預處理方法

在采集生物膜樣品前，需完成平臺進水水樣采集。水樣采集完成后，切斷該平臺的供水，為了防止生物膜脫落，緩慢排掉裝置中的水，之后卸下管段并移至干凈場所，用已滅菌的刷子、三腳架、托盤和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)對管段生物膜進行采集[28]。將刷下來的生物膜樣品放在利用冰袋維持低溫的環境中，并在2 h內送到實驗室，保存在4 ℃冰箱中。

為保證實驗結果的準確性，生物膜樣品需要在采集后的24 h內進行預處理，預處理流程按照Peng等[29]制定的方法進行。

濾膜上的微生物用FastDNA SPIN kit for Soil(MP Biomedicals，美國)提取樣品的基因組DNA，具體操作步驟按照說明書進行。提取后的DNA被定容于50 μL無核酸酶溶液(DNase/Pyrogen-free solution)中，最后保存于-80 ℃冰箱。

1.4 理化指標檢測方法

水體中的pH、溶解氧(dissolved oxygen, DO)、溫度、余氯、渾濁度、總有機碳(total organic carbon, TOC)、總磷、總氮、氨氮等指標的檢測方法均按照文獻[30]的步驟進行。

1.5 宏基因組測序

將生物膜樣品送至華大基因(中國)與浙江大學農生環測試中心進行高通量測序，使用Illumina HiSeq X Ten平臺進行雙端150 bp的宏基因組測序。本文分析的宏基因組測序原數據已保存到美國國家生物技術信息中心(NCBI)序列讀物檔案庫(SRA)中，登錄號為PRJNA 659358。

1.6 數據分析方法

將測序公司返回的FASTQ格式的原始測序數據用SolexaQA2[31]進行質量檢測，只保留Phred質量分數大于等于20的序列[21]。每個樣本的clean data 大約有10 GB。然后將序列上傳MG-RAST平臺(版本4.0.3)[32]，與Silva-SSU、SEED Subsystem數據庫進行比對，比對條件為：E截止值為10-5，最小識別率為60%，最小比對長度為50 bp，比對結果即為樣品中微生物群落組成和功能基因分布。

先前已有研究對抗生素抗性基因進行歸一化處理[33-34]，本文的抗生素抗性基因的類型豐度以10-6為單位，即百萬個讀數中的一個讀數[35-36]。

將所有測定數據導入 Excel 進行初步整理，所有統計分析均使用統計軟件IBM SPSS Statistics 24和R Studio 進行?；贐ray-Curtis距離對生物膜細菌群落進行聚類分析，并使用主坐標分析(PCoA)圖進行可視化。使用Bray-Curtis距離矩陣(具有999個排列)進行相似性分析(ANOSIM)，研究不同管材樣本之間差異的顯著性。統計檢驗在P<0.05被認為顯著。

2 結果與分析

2.1 中試平臺進水的理化指標

表2顯示了中試平臺進水水質的理化性質，菌落總數超過《生活飲用水衛生標準》(GB 5749—2006)要求的100 CFU/mL，其余指標均符合國標。

表2 中試平臺進水水質

2.2 不同管材細菌群落結構分布

如圖2所示，在DCIP的生物膜中，其主要細菌屬，按相對豐度的降序排列，是假單胞菌屬(4.40%～22.33%)與黃桿菌屬(Flavobacteriumspp. )(2.09%～18.35%)，這與之前美國伊利諾伊州進行的DWDS研究一致[37]。在HDPE生物膜中，其主要細菌屬是不動桿菌屬(Acinetobacterspp.)(0.05%～34.66%)與黃桿菌屬(3.17%～10.63%)，這與先前針對PVC和PEX管道進行的研究一致[38]。在GSP生物膜中，其主要細菌屬是土生單胞菌屬(Terrimonasspp.)(1.45%～21.87%)與馬賽菌屬(Massiliaspp.)(4.92%～21.04%)。在SSCP生物膜中，其主要細菌屬是鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonasspp.)(2.84%～24.43%)與短波單胞菌屬(Brevundimonasspp.)(4.71%～10.13%)，先前也曾在DWDS生物膜中發現過這兩種細菌[39]。在SP生物膜中，其主要細菌屬是噬幾丁質菌屬(Chitinophagaspp.)(0.35%～27.52%)與不動桿菌屬(5.12%～7.10%)。

圖2 不同管材生物膜細菌屬水平的相對豐度

如圖3所示，PCoA圖顯示不同管材生物膜細菌群落之間分離清晰，揭示了不同管材生物膜細菌群落區別明顯。相似性分析(ANOSIM)確認差異顯著(R=0.517，P<0.01)，表明管道材料在微生物群落中起著重要的作用。

圖3 基于各生物膜樣品Bray Curtis距離的PCoA圖

2.3 使用鳥槍宏基因組測序鑒定致病菌結果

為了確定致病菌，將13個樣本的宏基因組數據分類學結果與包含538種致病菌的致病菌數據庫[40]進行了比較，在所有13個樣本中共鑒定出96個屬149種的致病菌。如圖4所示，5種管材共享15種致病菌，這些致病菌總量占據每種管材相對豐度77%～93%。DCIP生物膜中致病菌種類最為豐富，發現86種致病菌，GSP致病菌種類最少，發現55種致病菌。DCIP特有致病菌為22種，數量最為豐富，相對豐度為3.7%；GSP生物膜特有致病菌為8種，數量最少，相對豐度為2.6%。

圖4 展示不同管道材料中致病菌種數量的Venn圖

如圖5所示，DCIP生物膜中的致病菌平均相對豐度最高，達6.4%，GSP生物膜中的致病菌平均相對豐度最低，為1.61%，兩種管材之間生物膜致病菌群落具有顯著差異(P<0.05)。致病菌種的平均相對豐度在5種管材分布情況為DCIP>SP>HDPE>SSCP>GSP，以往的研究也證實了這一點。Srijan等[41]發現SSCP是金屬管中控制致病菌的最佳管材，與DCIP相比，SSCP表面光滑且耐腐蝕，不利于微生物的附著。對于GSP的研究尚少，Silhan等[42]發現相比塑料管與銅管，大腸桿菌在GSP上的存活時間最短，GSP更不利于致病菌生存。DCIP具有較高的表面粗糙度，有利于微生物在內壁滋生[43]，此外，鐵是細菌繁殖必不可少的元素，當從鐵管中釋放后，會促進生物膜的生長[4]，還可以消耗殘留的消毒劑[44]，從而提高致病菌的存活率。重要的是致病菌獲取鐵與引發細菌性疾病相關，鐵的缺失會降低細菌的毒力[45]。本研究同樣證明了這一點(圖6)，基于SEED subsystem分類的一級功能組成顯示，DCIP生物膜中“鐵的攝取與代謝”平均相對豐度在5種管材中最高，明顯高于GSP生物膜(P<0.05)。5種管材中，含致病菌最為豐富的屬為不動桿菌屬，其次是假單胞菌屬、從毛單胞菌屬(Comamonasspp.)、短波單胞菌屬、羅爾斯通氏菌屬。

圖5 不同管材生物膜致病菌種的相對豐度

圖6 不同管材生物膜鐵的攝取與代謝功能基因的平均相對豐度

2.4 不同管材相關致病菌的識別

在所有鑒定出的致病菌種中，熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)、醋酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)和銅綠假單胞菌是4種含量最豐富的致病菌，也是目前常被研究的典型致病菌。相比其他4種管材，如圖7所示，鮑曼不動桿菌和醋酸鈣不動桿菌更偏向在HDPE和SP上分布，這與不動桿菌屬分布情況相似。細菌熒光假單胞菌與銅綠假單胞菌更易在DCIP上生長，與假單胞菌屬分布情況相似，這證實了課題組之前的研究結果——黃桿菌屬、短桿菌屬(Brevibacteriumspp.)、假單胞菌屬等菌屬對銅綠假單胞菌的生長具有促進作用。有基于模擬供水管道的研究發現銅綠假單胞菌在鐵管生物膜中的含量少于PE管和水泥管[46]，這與本文所得結論相悖，表明模擬供水管道與真實管道中的致病菌分布有差異。此發現對供水管網致病菌研究起到指導意義。

圖7 不同管材典型致病菌的平均相對豐度

在這項研究中，為了識別與5種管道材料相關的致病菌，規定兩項嚴格的標準：1)在某一種管材生物膜中觀察到該種致病菌的相對豐度占所有5種管材相對豐度之和的60%以上；2)該種致病菌在5種管材生物膜上的總相對豐度在0.5%以上[40]。將滿足上述兩個條件的致病菌分別稱稱為DCIP、HDPE、GSP、SSCP和SP相關致病菌，得到以下5種分布特征(如表3)：1)DCIP相關致病菌，如熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、狗咬二氧化碳嗜纖維菌(Capnocytophagacynodegmi)、缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminuta)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、類產堿假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactia)和豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)。2)HDPE相關致病菌，如抗輻射不動桿菌(Acinetobacterradioresistens)。3)GSP相關致病菌，如食酸戴爾福特菌(Delftiaacidovorans)。4)SSCP相關致病菌，如約翰遜不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii)。5)SP相關致病菌，如洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)、淺綠氣球菌(Aerococcusviridans)、成團泛菌(Pantoeaagglomerans)和皮氏羅爾斯頓菌(Ralstoniapickettii)。

2.5 不同管材生物膜中抗生素耐藥全球優先致病菌

2017年，世界衛生組織(WHO)首次發布了全球關于抗生素耐藥細菌的優先致病菌(priority pathogens)名單，以幫助研究和開發抗生素耐藥性的新療法[47]。該名單一共包含了12類致病菌，分成3個優先級，即首要、高級和中級。本研究在5種供水管道生物膜中共檢測到9類全球優先致病菌(本文中出現的所有全球優先致病菌不一定攜帶耐藥基因)。如表3所示，在5種管材中，HDPE和SP生物膜中的優先致病菌含量最為豐富，分別為1.032%和1.084%，GSP的最低，為0.079%。根據對人類健康的危害，耐碳青霉烯的鮑曼不動桿菌在WHO的優先致病菌名單占據首位，銅綠假單胞菌占據第二位，這兩種細菌也在本研究被大量發現，可見供水管道微生物膜的潛在危害性。級別為首要的3類致病菌占總優先致病菌總數的91%～99%，這3種菌均對碳青霉烯類藥物產生抵抗性，表4顯示了與碳青霉烯抗性相關的β-內酰胺酶基因的豐度。