復(fù)發(fā)性流產(chǎn)基因缺陷分析及臨床意義＊

閔愛萍 羅曉 馮欣 夏秀英 許洪梅 梁瓊?cè)A

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)是2次或2次以上妊娠失敗[1]。在我國通常指與同一配偶連續(xù)發(fā)生3次或3次以上在妊娠28周之前的胎兒丟失，但大多數(shù)專家認(rèn)為，連續(xù)發(fā)生2次流產(chǎn)即應(yīng)重視并予評(píng)估，因其再次出現(xiàn)流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)與3次者相近[2]。研究表明，遺傳缺陷是導(dǎo)致自然流產(chǎn)的主要原因，RSA胚胎染色體異常率高于偶發(fā)自然流產(chǎn)。本研究采用高通量測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）檢測流產(chǎn)胚胎及絨毛組織染色體DNA拷貝數(shù)，有助于尋找可能的遺傳學(xué)因素和父母雙方遺傳學(xué)背景，對(duì)再次妊娠采取有針對(duì)性的孕前優(yōu)生指導(dǎo)提供遺傳學(xué)依據(jù)[3]?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

整群抽樣選取2015年12月-2020年1月在樂山市人民醫(yī)院自然流產(chǎn)患者流產(chǎn)組織樣本105例，排除1例樣本不合格，4例放棄檢測，有效統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)100例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）流產(chǎn)或引產(chǎn)前B超檢查均提示胚胎或胎兒停止發(fā)育；（2）孕周<28周。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）已知有家族性基因遺傳疾??；（2）計(jì)劃不再生育；（3）樣本不合格；（4）患者及家屬放棄檢測。其中1次自然流產(chǎn)患者38例，2次自然流產(chǎn)患者49例，≥3次自然流產(chǎn)患者13例。胎兒丟失≥2次診斷為RSA?；颊吣挲g為20～42歲，平均（29.07±4.83）歲，胚胎停育孕周為7+6～27+4周。研究經(jīng)醫(yī)院科技委員會(huì)（樂市醫(yī)院科委【2016】11號(hào)）和倫理委員會(huì)（樂市醫(yī)院倫委【2016】38號(hào)）批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 NGS檢測方法

利用NGS技術(shù)對(duì)流產(chǎn)組織（包括胎兒皮膚組織、絨毛組織）進(jìn)行染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常檢測。在無菌條件下取流產(chǎn)組織物50～100 mg，用0.9%的無菌生理鹽水多次漂洗并固定標(biāo)本，放入無菌標(biāo)本瓶中送檢。與廣州達(dá)安臨床檢測中心合作，在知情同意基礎(chǔ)上進(jìn)行染色體異常檢測（NGS），使用廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司的核酸提取及純化試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行基因組DNA的提取，使用文庫構(gòu)建通用試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，最后使用測序通用試劑盒在高通量測序儀上進(jìn)行測序，完成對(duì)基因組拷貝數(shù)的檢測。

1.3 觀察指標(biāo)

胚胎染色體NGS檢查和父親雙方染色體核型分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流產(chǎn)樣本特征

流產(chǎn)事件主要集中在孕早期（<12周），占66%，見表1。

表1 流產(chǎn)樣本特征

2.2 不同年齡段染色體異常發(fā)生情況比較

將孕期胚胎停育流產(chǎn)組織樣本依年齡分為4組，不同年齡段染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.336，P>0.05），見表2。

表2 不同年齡段染色體異常發(fā)生情況比較例

2.3 不同流產(chǎn)次數(shù)患者染色體異常發(fā)生情況比較

初次流產(chǎn)患者染色體異常發(fā)生率較高，但與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），從數(shù)據(jù)得出流產(chǎn)次數(shù)越多，胚胎染色體異常比例越高，見表3。

表3 不同流產(chǎn)次數(shù)患者染色體異常發(fā)生情況比較例

2.4 胚胎染色體異常與夫妻染色體異常情況

100例自然流產(chǎn)樣本中54例胚胎染色體異常，其中42對(duì)夫妻進(jìn)行了染色體核型檢查，6例母親染色體核型異常，3例丈夫染色體核型異常，1例夫妻雙方染色體核型異常，由夫妻染色體異常導(dǎo)致的胚胎染色體異常比例低，僅為18.5%（10/54），見表4。

表4 胚胎染色體異常與夫妻染色體異常情況

2.5 流產(chǎn)組織NGS檢測結(jié)果

100例染色體送檢樣本異常染色體54例，其中初次流產(chǎn)患者22例，RSA患者32例。

2.5.1 初次自然流產(chǎn)染色體異常情況 38例初次自然流產(chǎn)患者流產(chǎn)組織染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常的陽性標(biāo)本22例，占57.9%（22/38），數(shù)目異常21例，結(jié)構(gòu)異常1例，整套染色體單親二倍體0例，染色體非整倍體率為55.3%（21/38）。常染色體三體10例，以16號(hào)（5/21，23.8%）、4號(hào)（3/21，14.3%）、22號(hào)（2/21，9.5%）染色體高發(fā)。性染色體數(shù)目異常4例，結(jié)構(gòu)異常1例，常染色體合并性染色體異常2例，嵌合體5例。除1例92，XXXX四倍體外其余均檢測出非整倍體，染色體片段≤5 Mb的結(jié)構(gòu)異常發(fā)生率占陽性標(biāo)本比例為4.5%（1/22），其中以染色體結(jié)構(gòu)重復(fù)為主，缺失次之，見表5。

表5 22例初次自然流產(chǎn)染色體異常情況

2.5.2 RSA染色體異常情況 62例RSA患者流產(chǎn)組織染色體數(shù)目異常及結(jié)構(gòu)異常32例，占51.6%（32/62），陰性標(biāo)本占48.4%（30/62）。數(shù)目異常31例，結(jié)構(gòu)異常1例，整套染色體單親二倍體0例，染色體非整倍體率為51.6%（32/62），常染色體三體22例，13-三體并21-三體并22-三體1例，8-單體并22-三體1例，1-單體并3-三體1例，性染色體數(shù)目異常2例，三倍體5例，未檢測出嵌合體。以16號(hào)（5/32，15.6%）、X 號(hào)（5/32，15.6%）、22號(hào)（3/32，9.4%）、13號(hào)（3/32，9.4%）染色體高發(fā)，其中69，XXX三倍體1例，無染色體數(shù)目異常，僅有結(jié)構(gòu)異常，也以染色體結(jié)構(gòu)重復(fù)為主，缺失次之，見表6。

表6 32例RSA染色體異常情況

2.6 拷貝數(shù)異常（CNV）與致病性情況

檢索ClinGen、Decipher數(shù)據(jù)庫（染色體變異已知綜合征和病例數(shù)據(jù)庫）、OMIM數(shù)據(jù)庫（遺傳病、性狀和基因的數(shù)據(jù)庫）、DGV數(shù)據(jù)庫（正常人染色體拷貝數(shù)數(shù)據(jù)庫）。共檢出微重復(fù)（<10 Mb）9例，占16.67%（9/54）。38例初次自然流產(chǎn)樣本22例CNV，致病CNV 28個(gè)；62例復(fù)發(fā)性樣本32例CNV，致病CNV 37個(gè)。

3 討論

隨著現(xiàn)代社會(huì)壓力增高，環(huán)境污染不斷惡化等因素導(dǎo)致RSA的發(fā)生呈逐年上升趨勢。目前認(rèn)為胎兒染色體發(fā)生異常的常見影響因素有兩個(gè)，一是年齡，二是家族史[4]。大部分胚胎染色體異常是由于生殖細(xì)胞受到內(nèi)外界環(huán)境影響導(dǎo)致染色體不分離或突變引起的[5]，可發(fā)生在染色體正常的夫婦，并不一定是垂直遺傳[6]。胚胎死亡和自然流產(chǎn)是胚胎早期發(fā)育自然選擇的主要途徑[7]，臨床上自然流產(chǎn)的發(fā)生率為15%～25%[1]，且80%以上發(fā)生在妊娠12周前[8]，流產(chǎn)發(fā)生越早，其胚胎染色體異常的發(fā)生率越高[9]，胚胎染色體異常是RSA最常見的原因，占半數(shù)以上[10-11]。自然流產(chǎn)染色體異常絕大多數(shù)為數(shù)目異常占85%～90%，以16、18、21三體和X染色體單體為主[12-13]；染色體結(jié)構(gòu)異常占6%～10%，包括易位、倒位、缺失、重復(fù)等；染色體嵌合占8%[14]。目前沒有任何一種染色體檢測方法是完美無缺的[15]，常規(guī)染色體核型分析是診斷早期流產(chǎn)的金標(biāo)準(zhǔn)，但檢出率較低[16]，近年來NGS技術(shù)用于檢測流產(chǎn)組織的非整倍體和拷貝數(shù)變異（copy number variation， CNV），還能發(fā)現(xiàn)未知改變[17]，被各大醫(yī)院廣泛推崇[18]。雖然該技術(shù)有諸多優(yōu)勢，但不能發(fā)現(xiàn)染色體平衡易位、倒位或點(diǎn)突變及染色體整倍體[19]，因此筆者認(rèn)為各種染色體檢測方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)取長補(bǔ)短，為臨床精準(zhǔn)診療提供了新的思路和方法[20-22]。

本研究運(yùn)用NGS技術(shù)對(duì)100例自然流產(chǎn)患者的流產(chǎn)組織成功進(jìn)行了檢測，既往研究認(rèn)為年齡是影響胚胎染色體異常的重要因素，隨著年齡的增長，減數(shù)分裂過程中紡錘體形成的誤差率增加[23]，受精卵中出現(xiàn)染色體異常的分離和復(fù)制有關(guān)。但本研究結(jié)果顯示≤30歲自然流產(chǎn)發(fā)生率占66%，發(fā)生在12周前自然流產(chǎn)發(fā)生率也占66%，從數(shù)據(jù)得出流產(chǎn)次數(shù)越多，胚胎染色體異常比例越高。統(tǒng)計(jì)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，RSA患者胚胎染色體數(shù)目異常率高于初次自然流產(chǎn)患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

本研究三體型與單體型發(fā)生率與文獻(xiàn)[24-25]報(bào)道基本相符，最常見的三倍體主要發(fā)生在16、4、22、X、13號(hào)染色體上，但RSA患者與初次自然流產(chǎn)患者染色體非整倍體發(fā)生略有差異，RSA染色體三倍體發(fā)生順位以16、X、13、22號(hào)染色體高發(fā)為主，而初次自然流產(chǎn)以16、4、22號(hào)染色體高發(fā)為主，究其原因不除外樣本量少造成的統(tǒng)計(jì)差異，但也可能提示染色體三倍體發(fā)生位置不同導(dǎo)致的流產(chǎn)再發(fā)生率不同。單倍體主要發(fā)生在X染色體單體上，RSA患者X染色體三倍體占比較高，與文獻(xiàn)[24-25]報(bào)道基本相一致。本研究初次自然流產(chǎn)和RSA X染色體單體發(fā)生率基本相等，由于單體型染色體異常的原因除減數(shù)分裂時(shí)性染色體不分離，導(dǎo)致減少一條性染色體外，其中大約75%是父系性染色體丟失，該結(jié)果可能提示，由于父系性染色體丟失，X染色體單體發(fā)生率越高越易造成自然流產(chǎn)，該方面有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并深入研究。

本研究在組織樣本中檢測出1號(hào)與19號(hào)染色體非整倍體異常，既往文獻(xiàn)[26]報(bào)道未能檢測出此2種染色體異常，彌補(bǔ)了該空缺。在染色體異常造成的異常流產(chǎn)性疾病中，主要以染色體結(jié)構(gòu)重復(fù)為主，染色體結(jié)構(gòu)缺失次之，與文獻(xiàn)報(bào)告不一致。由夫妻雙方染色體異常導(dǎo)致的胚胎染色體異常比例低，僅為18.5%（10/54）。檢索文庫得出38例首次自然流產(chǎn)樣本致病CNV 28個(gè)，62例復(fù)發(fā)性樣本致病CNV 37個(gè)。包括16-三體綜合征、21-三體綜合征、Schmid-Frac-caro氏綜合征（Schachenmann氏綜合征）、虹膜缺損-肛門閉鎖綜合征、G三體綜合征、貓眼綜合征、Tuner綜合征、1p36缺失綜合征、8q部分單體綜合征、Patau綜合征、18-三體綜合征（愛德華氏綜合征）、XXY綜合征（克氏綜合征、先天性睪丸發(fā)育不全）等。NGS技術(shù)可覆蓋全基因組進(jìn)行CNV分析，除了可以發(fā)現(xiàn)非整倍體改變外，還可發(fā)現(xiàn)致病性及可能致病性CNV，可明顯提高異常檢出率[27]。但仍有一部分染色體拷貝重復(fù)或缺失臨床意義尚不明確。

本研究采用NGS技術(shù)檢測出樣本微重復(fù)（<10 Mb）9例，檢索數(shù)據(jù)庫了解相關(guān)的致病基因和可能導(dǎo)致的疾病，這在常規(guī)染色體核型分析中很難或不能被發(fā)現(xiàn)，具有重大臨床意義。同時(shí)NGS將染色體的診斷水平提高到基因水平，在遺傳學(xué)分析中表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。筆者建議，臨床診療實(shí)際工作中，應(yīng)重視遺傳學(xué)病因的篩檢，可將NGS技術(shù)應(yīng)用于RSA遺傳學(xué)病因的研究，為臨床實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。當(dāng)然，RSA病因探尋除遺傳學(xué)因素外，還包括染色體多態(tài)性[28]、內(nèi)分泌、免疫、解剖、血漿高凝狀態(tài)及環(huán)境、生活方式等因素[29]，應(yīng)綜合全面評(píng)估，才有利于指導(dǎo)再次妊娠[30]。