活化的PPAR-γ對潰瘍性結腸炎大鼠Th細胞的調控研究

曹艷 程正位 程思

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是結腸和直腸的慢性非特異性炎癥性疾病，病變局限于大腸黏膜及黏膜下層[1]，特征是腸道炎癥反復和病程長，潰瘍性結腸炎發病原因及機制復雜，目前尚不明確，有研究認為該病是由遺傳、環境、免疫及精神心理等多種不同因素共同作用的結果，而免疫調節在該病中具有重要作用[2]。潰瘍性結腸炎的腸道病變不僅與上皮炎癥和壞死有關，也與上皮細胞過度凋亡有關，過氧化物酶體增生物激活受體-γ（peroxisome proliferator activated receptor-gamma， PPAR-γ）可能參與了潰瘍性結腸炎腸道炎癥的調控。近年來研究表明UC患者T細胞免疫失衡與其發病機制密切相關[3-4]。PPAR-γ屬于核激素受體超家族的亞族，為配體依賴性轉錄因子，近年發現，PPAR-γ廣泛表達于T細胞、B細胞等免疫細胞，參與機體的免疫調節。目前研究表明，PPAR-γ可通過參與調控Th1/Th2細胞分化而發揮免疫調節功能[5-6]。本文旨在研究配體活化的PPAR-γ對潰瘍性結腸炎模型大鼠T細胞免疫紊亂的調控作用，為UC的臨床治療提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與材料

實驗動物（SD）大鼠60只（購自實驗動物中心），重量（200±20）g，酶標儀及IFN-γ、IL-4的ELISA試劑盒購自深圳達科為科技公司，TZD類藥物羅格列酮片為葛蘭素史克公司出品，4 mg/片；UC的陽性藥物柳氮磺吡啶（SASP）為上海三維制藥有限公司產品，0.25 g/片；三硝基苯磺酸（TNB）購自Sigma公司。

1.2 潰瘍性結腸炎大鼠模型的建立

實驗模型建立及分組[7]：取實驗動物（SD）大鼠60只，其中50只應用三硝基苯磺酸（TNB）/乙醇方法制備大鼠潰瘍性結腸炎模型，實驗前禁食24 h，自由飲水，10%（w/v）水合氯醛腹腔麻醉（300 mg/kg），將TNB溶于500 ml/L乙醇至終濃度100 g/L，取塑料導管一根，術前石蠟油潤滑，從大鼠肛門中插入深度約8 cm，緩慢推注TNB/乙醇溶液，每只大鼠約0.3 ml，推注完畢后緩慢拔出硅膠管，以手壓迫肛門并抬高鼠尾。實驗設正常對照組（健康小鼠）、模型對照組、SASP處理組（SASP，100 mg/kg）、低劑量羅格列酮組（羅格列酮2 mg/kg）、中劑量羅格列酮組（羅格列酮4 mg/kg）、高劑量羅格列酮組（羅格列酮8 mg/kg），每組10只，SASP處理組每天給予SASP 100 mg/kg混懸液灌胃，不同劑量羅格列酮組分別每天給予羅格列酮2、4、8 mg/kg混懸液灌胃，正常對照組、模型對照組每天給予等體積生理鹽水3 ml/只灌胃，每天灌胃給藥1次，給藥時間從造模后第2天至實驗結束共10 d，每日觀察大鼠一般狀況及糞便性狀，記錄評分。

1.3 觀察指標及評價標準

1.3.1 疾病活動指數（DAI） DAI=體重下降分數+糞便性狀分數+便血分數。每日記錄各組動物體重和大便性狀，采用DAI對動物狀態進行綜合評分[8]。體重：不變為0分，比正常下降1%～5%為1分，下降6%～10%為2分，下降11%～15%為3分，下降15%以上為4分。大便黏稠度：正常為0分，松散的大便為2分，腹瀉為4分。大便出血：正常為0分，顯性出血為2分。

1.3.2 ELISA法檢測各組外周血中IFN-γ、IL-4的水平 在培養的最后1天（第10天）取大鼠尾靜脈血，并分離上清，采用ELISA法檢測血清中IFN-γ、IL-4水平，具體操作按試劑盒提供的說明書進行，每個樣本和標準品均設3個復孔，酶標測試儀450 nm處讀數，計算Th1型與Th2型細胞因子的比值IFN-γ/IL-4。

1.4 統計學處理

本研究數據采用SPSS 18.0統計學軟件進行分析和處理，實驗結果以表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組DAI比較

與正常對照組比較，模型對照組與低劑量羅格列酮組DAI更高，差異有統計學意義（P<0.05）；SASP處理組和中、高劑量羅格列酮組與正常對照組DAI比較差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 各組DAI比較 [分，（±s）]

表1 各組DAI比較 [分，（±s）]

*與正常對照組比較，P<0.05；#與正常對照組比較，P>0.05。

組別 D A I正常對照組（n=1 0） 0.7 5±0.1 7模型對照組（n=1 0） 4.9 1±2.2 5*S A S P處理組（n=1 0） 0.8 4±0.2 1#低劑量羅格列酮組（n=1 0） 3.2 2±1.5 4*中劑量羅格列酮組（n=1 0） 0.8 8±0.2 7#高劑量羅格列酮組（n=1 0） 0.7 1±0.1 5#

2.2 UC大鼠模型經過藥物處理前后外周血中細胞因子的變化比較

模型對照組IFN-γ/IL-4高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05），SASP處理組IFN-γ/IL-4與正常對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）；中、高劑量羅格列酮組IFN-γ/IL-4與正常對照組及SASP處理組比較差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

表2 UC大鼠模型處理組與正常對照組外周血細胞因子的檢測（±s）

表2 UC大鼠模型處理組與正常對照組外周血細胞因子的檢測（±s）

*與正常對照組比較，P<0.05；#與正常對照組比較，P>0.05。

IFN-γ/IL-4正常對照組（n=10） 13.40±6.22 19.26±5.12 0.70±0.21模型對照組（n=10） 20.42±7.54* 14.02±4.92* 1.46±0.51*SASP 處理組（n=10） 14.50±4.22# 18.20±5.76# 0.79±0.37#低劑量羅格列酮組（n=10） 18.42±6.54* 15.02±5.92* 1.16±0.41*中劑量羅格列酮組（n=10） 14.56±3.28# 19.70±4.16# 0.74±0.32#高劑量羅格列酮組（n=10） 13.56±3.28# 18.90±5.16# 0.73±0.23#組別 IFN-γ（pg/ml）IL-4（pg/ml）

3 討論

潰瘍性結腸炎是一種病因不明的結腸黏膜和黏膜下炎癥性疾病，重者可發生潰瘍。目前認為UC是多種因素，如遺傳、環境、免疫因素在具有遺傳易感性的宿主中通過異常黏膜免疫反應引起的。TNB類藥物誘導的結腸炎模型表達Th2型細胞因子，中性粒細胞浸潤局限于黏膜淺層，類似于人類UC，已廣泛應用于UC發病機制、藥物療效評價等研究。PPAR-γ屬于核激素受體超家族的亞族，為配體依賴性轉錄因子，主要有α、γ和δ/β三種亞型，其在脂代謝、糖代謝和腫瘤細胞的分化和凋亡中起重要作用。近年發現，PPAR-γ廣泛表達于T細胞、B細胞、NK細胞等免疫細胞，參與機體的免疫調節[9-11]。Th1和Th2細胞都是輔助T細胞，其通過分泌多種細胞因子使人體產生免疫應答[12]。Th1細胞主要分泌IL-2和IFN-γ，參與細胞免疫和遲發性超敏性炎癥反應；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，其可輔助B細胞分化為抗體分泌細胞，參與體液免疫應答。目前更有研究表明，PPAR-γ可通過參與調控Th1/Th2細胞分化而發揮免疫調節功能。但是活化的PPAR-γ在動物實驗中對UC的Th細胞的免疫調節作用尚不明確[13-15]。

在本次實驗中，通過構建了UC的大鼠模型，探討活化的PPAR-γ對UC模型大鼠外周血中Th1/Th2細胞分化相關細胞因子的影響。與正常對照組比較，模型對照組與低劑量羅格列酮組DAI更高，差異有統計學意義（P<0.05），SASP處理組及中、高劑量羅格列酮組與正常對照組DAI比較差異無統計學意義（P>0.05），這為該實驗的合理性提供佐證。在經過藥物處理前后外周血中細胞因子的變化比較中，模型對照組Th1型與Th2型細胞因子的比值高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05），SASP處理組IFN-γ/IL-4與正常對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）；中、高劑量羅格列酮組IFN-γ/IL-4與正常對照組、SASP處理組比較差異無統計學意義（P>0.05），提示羅格列酮可通過激活PPAR-γ的活化，參與調控Th1/Th2細胞分化，從而發揮緩解結腸炎癥的作用，但具體的機制有待進一步研究。

目前，潰瘍性結腸炎的病例日益增多，臨床治療面臨困境，常規治療手段療效不佳或副作用多。活化的PPAR-γ可調節Th1/Th2細胞分化，且應用合成的PPAR-γ配體（TZD）治療一些自身免疫性疾病，具有療效好、副作用小、耗費低等優點，從而有可能成為治療UC的有效藥物。因此本課題為闡明配體活化的PPAR-γ調節UC患者外周血Th1/Th2細胞分化的分子機制，為該藥應用于UC的臨床治療提供了實驗數據，同時還可為臨床上Th1/Th2細胞分化失衡的其他免疫調節失衡性疾病的治療提供了新靶點和手段[16]。