不同叢枝菌根真菌菌劑對滇重樓及土壤中營養元素的影響

趙順鑫，魏祖晨，李卓蔚，許凌峰，郭冬琴，周 濃，杜慧慧

重慶三峽學院生物與食品工程學院 三峽庫區道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404120

作為植物生長直接基質的根際土壤為植物的生長發育提供保障，土壤中的微生物組成及酶活力影響著土壤微生態系統，對土壤理化性質、養分循環和植物生長等具有重要的影響[1]。土壤微生物群落在調控土壤物質循環和改善土壤質量起到關鍵性作用[2]。叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)真菌可以改善土壤的營養成分，促進植物養分吸收利用，提高藥用植物的產量和品質[3,4]，同時對污染土壤、鹽堿土壤的生態恢復發揮積極作用[5]。

野生滇重樓資源的枯竭，使得人工栽培和引種栽培成為滇重樓研究的主流[6]。但因其地理位置，種植年限的差異，導致滇重樓的品質不一[7]。據報道，接種不同AM真菌能夠提高滇重樓薯蕷皂苷元的含量、改善土壤的理化性質、提高土壤養分和優化微生物結構[7,8]，促進滇重樓幼苗期葉片葉綠素合成，提高幼苗光合能力[9]。Zhang等[10]報道滇重樓種子共生萌發時接種薄壁兩性囊霉(Ambisporaleptoticha)和崔氏原囊霉(Archaeosporatrappei)可提高滇重樓幼苗的成活率和產量。另外，接種不同AM真菌可以促進滇重樓根際對土壤營養元素的吸收利用、提高滇重樓品質[11]。Yang等[12]發現接種優選的混合AM真菌菌劑增加滇重樓根中內源激素含量比接種單株真菌的效果更好。前期研究[13]發現不同AM真菌混劑能夠提高根際土壤中球囊霉素含量和酶活性，改變微生物群落結構，從而改善土壤環境，也能促進滇重樓對外界不利環境的抗逆性，提高滇重樓總皂苷含量，誘導滇重樓次生代謝的變化，增加有效成分，從而提升滇重樓的藥用品質。

通過接種AM真菌改善土壤環境和提升藥材品質已成為一種趨勢。土壤中營養元素含量水平受栽培土壤營養水平和植株自身習性的影響[14]。Shen等[15]發現，接種不同AM真菌后滇重樓根莖和根際土壤中的鈣、鎂、鈉等含量均高于未處理組，且促進根莖對元素的吸收來提高品質。Gu等[16]研究表明，不同AM真菌混合接種可增加木香對營養物質的吸收，促進代謝產物的積累，提高木香內脂的產量和入藥品質。而接種不同AM真菌混劑后對滇重樓和土壤微生態中營養元素影響的研究較少。基于此，本研究通過接種不同組合的AM真菌菌劑后，測定滇重樓不同部位以及土壤中的營養元素的含量，旨在解析不同AM真菌菌劑對滇重樓和土壤中營養元素的影響，以期能夠最大化利用土壤的營養元素，減少資源浪費，同時為滇重樓生物菌肥的研發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與培養

樣品于2013年10月采自云南省大理白族自治州農業科學推廣研究院種植基地(25°35′27.69′′N，100°18′23.17′′E，海拔1 980 m，年均氣溫14.9 ℃，年降雨量1 051.1 mm)，經重慶三峽學院生物與食品工程學院周濃教授鑒定為百合科重樓屬滇重樓P.polyphyllavar.yunnanensis。選擇大小一致且無蟲害的滇重樓新鮮根莖為研究對象。12種AM真菌菌劑均購自美國國際叢枝菌根真菌種質資源保藏中心(INVAM)，由重慶三峽學院微生物實驗室進行擴增繁殖、儲存保管。菌劑擴繁的基質使用山基土和河沙按3∶1體積比混合制成[11]。

栽培基質為菜園土與河沙按體積3∶1混合，于高壓滅菌鍋內121 ℃滅菌2 h，置于口徑15 cm，高18 cm的無菌塑料容器中。采用室溫盆栽的方法，于重慶市萬州區鐵峰山國家森林公園內試驗種植基地(30°56′12.05′′N，108°22′32.89′′E，海拔1 230 m)進行種植。分別設置叢枝菌根真菌處理組S1～S9和對照組CK，每盆3株苗，每組10個重復。不同處理組每盆接種含4或6種叢枝菌根真菌共120枚孢子的混合菌劑(均分)，并定期澆灌Hoagland營養液，具體信息詳見表1。

表1 不同處理組及其接種叢枝菌根真菌Table 1 Different treatment groups and inoculation of AM fungi

1.2 樣品采集與處理

分別在4個時期(T1：2015年6月；T2：2015年7月；T3：2015年8月；T4：2015年9月)將滇重樓植株小心取出，不傷害其根系，獲得葉、莖、根莖和須根。采用He等[17]方法將靠近頂芽第一莖痕處并帶有頂芽的切段為新根莖，余下的部分為老根莖，置于45 ℃烘箱中烘干至恒重，粉碎過80目篩，用于滇重樓元素含量測定分析。同時采集土壤樣品，實驗室自然風干至恒重，粉碎過80目篩，用于土壤相關元素含量測定分析。

1.3 儀器與試劑

TAS-990AFG型原子吸收分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；C-MAG HP10型數顯加熱板(德國IKA集團)；DZF-6050MBE型電熱恒溫真空干燥箱(上海博訊實業有限公司)；鉀(K)、鈣(Ca)、鎂(Mg)空心陰極燈(北京曙光明電子光源儀器有限公司)；ME204E型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。所用水為去離子水，試劑均為優級純。

1.4 測定方法

采用凱氏定氮法[18]測定滇重樓與土壤中的氮元素含量，采用釩鉬黃比色法[19]測定滇重樓中的磷元素含量，采用硫酸-高氯酸消煮法[18]測定土壤中磷元素含量，采用原子吸收光譜法[20]測定滇重樓與土壤中鉀、鈣、鎂元素含量。

1.5 數據處理

采用Excel 2016軟件進行數據處理，使用SPSS 25分析軟件進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同采收時期滇重樓中氮、磷、鉀、鈣、鎂元素吸收和分布規律

滇重樓不同采收期其根、莖、葉中氮、磷、鉀、鈣、鎂含量分布規律如表2所示。就對照組而言，4個時期滇重樓不同部位氮含量整體表現為先升高后下降的趨勢，在T3時期新、老根莖氮的含量達到最大；T1時期，S3、S4、S5、S6和S7處理組滇重樓葉中氮的含量均增加，S7新根莖氮的含量增加，S6處理組滇重樓新根莖、老根莖和葉中氮的含量增加；S8處理組T1時期新、老根莖和葉，T2時期新根莖和葉以及T4時期新、老根莖中氮的含量增加。綜上，S8處理組氮含量的增加效果比較好。磷在滇重樓新根莖和葉中含量較高，其中T4時期S6處理組滇重樓的新、老根莖中磷含量最高。S8處理組T1時期新根莖中磷的含量增加，達6.289 g/kg。鉀元素可以影響植物品質及根莖次生代謝產物合成積累。對鉀的含量分析發現，鉀含量表現為莖>葉>根莖。T4時期S8處理組的老根莖中鉀含量較高，為12.715 g/kg。

表2 接種叢枝菌根真菌對滇重樓5種元素吸收的影響Table 2 Contents of five elements in P.polyphylla var.yunnanensis inoculated with AM fungi at different times(g/kg)

續表2(Continued Tab.2)

不同時期處理組滇重樓鈣含量大部分高于對照組，表明接種叢枝菌根真菌能有效提高滇重樓抗逆性，保證滇重樓正常生長。采收期對照組的滇重樓的鈣含量表現為莖>葉，老根莖>新根莖。而處理組的鈣含量新根莖>老根莖，表明不同處理組可促進新根莖對鈣元素的蓄積。其中S4、S6和S8處理組T1時期葉的鈣含量增加，S6處理組T1時期新根莖的鈣含量、T3時期莖和葉的鈣含量增加，S8處理組T1和T3時期莖和葉以及T4時期新、老根莖的鈣含量增加，推測S8處理組可以促進滇重樓對鈣的吸收，增加植物的抗逆性。對鎂含量進行測定分析發現，相較于對照組，不同處理組滇重樓鎂的含量不同程度發生改變。其中，T1、T4時期S6組的老根莖中鎂含量較高，T3時期新根莖含量較高。S8處理組在T1、T2和T4時期新根莖的鎂的含量較高，最高可達28.142 g/kg。因此，不同AM真菌混合后可不同程度上促進氮、磷、鉀、鈣、鎂的吸收及在根莖中的蓄積。

2.2 不同采收時期土壤中營養元素含量分析

通過凱氏定氮法、硫酸-高氯酸消煮法和原子吸收光譜法測定接種不同AM真菌菌劑后土壤中的氮、磷、鉀、鈣、鎂5種元素的含量。由表3可知，不同處理組土壤中的氮、磷、鉀、鈣、鎂5種元素的含量與對照組存在顯著差異。在T1、T3和T4時期，S8處理組的土壤中鈣的含量明顯比對照組高，且T1時期滇重樓不同部位的鈣含量，T3時期滇重樓莖和葉中，T4時期滇重樓新根莖中鈣的含量都明顯升高。表明土壤中的鈣含量的升高有利于植物各個部位鈣的蓄積及轉移。S6處理組在T2和T4時期鈣的含量最高，均大于141.000 g/kg。不同處理組土壤中的氮、磷、鉀和鎂元素的變化量不大，而S6、S8處理組滇重樓的新根莖、老根莖和葉中氮的含量顯著升高，S7處理組的新根莖和葉的氮含量也明顯增多，最高可達4.799 g/kg，T1時期S8和S1處理組滇重樓的新根莖的磷含量比其他處理組高，最高可達到6.289 g/kg，推測不同AM真菌可以促進滇重樓對氮元素的吸收和蓄積。

表3 接種叢枝菌根真菌不同時間土壤中五種元素含量Table 3 Contents of five elements in soils inoculated with AM fungi at different times(g/kg)

2.3 滇重樓與土壤元素相關性分析

為了分析滇重樓不同部位與栽培土壤中營養元素的關系，通過相關性分析發現，滇重樓老根莖與土壤中的營養元素有不同程度的相關性。老根莖中的氮與老根莖中鈣和鎂存在極顯著正相關(r=0.516、0.680，P<0.01)，老根莖中的鈣與鎂的含量呈顯著正相關(r=0.337，P<0.05)，老根莖中的鈣與土壤中的鈣呈顯著負相關(r=-0.315，P<0.05)，與土壤中的鎂存在極顯著負相關(r=-0.469，P<0.01)，土壤中的鈣與土壤中的鉀存在顯著負相關(r=-0.312，P<0.05)，土壤中的鎂和鈣存在極顯著正相關(r=0.455，P<0.01)，結果見表4。滇重樓新根莖與土壤中5種元素的相關性為：新根莖中的氮和磷呈極顯著正相關(r=0.407，P<0.01)，新根莖中的鎂和新根莖中的磷與鉀呈極顯著正相關(r=0.500、0.421，P<0.01)，土壤中的鈣和鉀呈顯著負相關(r=-0.312，P<0.05)，土壤中的鈣和鎂呈極顯著正相關(r=0.455，P<0.01)(見表5)。表6展示了滇重樓葉與土壤中5種元素存在一定的相關性：葉中的氮和鈣呈顯著正相關(r=0.407，P<0.05)，葉中的鉀與鎂呈極顯著正相關(r=0.587，P<0.01)，土壤中的鈣與葉中的磷呈顯著正相關(r=0.365，P<0.05)，與葉中的鉀呈顯著負相關(r=-0.362，P<0.05)，土壤中的鈣與土壤中的鉀呈顯著負相關(r=-0.438，P<0.05)，與土壤中的鎂呈顯著正相關(r=0.46，P<0.05)。

表4 不同叢枝菌根真菌處理滇重樓老根莖元素與土壤元素相關性分析Table 4 The correlation analysis of the old tuber elements and soil elements treated of P.polyphylla var.yunnanensis

表5 不同叢枝菌根真菌處理滇重樓新根莖元素與土壤元素相關性分析Table 5 The correlation analysis of the new tuber elements and soil elements treated of P.polyphylla var.yunnanensis

表6 不同叢枝菌根真菌處理滇重樓葉中元素與土壤元素相關性分析Table 6 The correlation analysis of leaf elements and soil elements of P.polyphylla var.yunnanensis

由表7可知，滇重樓莖與土壤中5種元素存在的相關性表現為：滇重樓莖中鉀與鈣存在顯著正相關(r=0.453，P<0.05)，滇重樓莖中的鉀與土壤中的磷呈顯著負相關(r=-0.384，P<0.05)，土壤中的鉀和鈣呈顯著負相關(r=-0.438，P<0.05)，土壤中的鎂與滇重樓莖中的鎂呈顯著負相關(r=-0.403，P<0.05)，與土壤中的鈣呈顯著正相關(r=0.446，P<0.05)。莖中鉀含量與鈣含量呈正相關，可能與鉀具有使莖干堅韌，增強植株抗機械損傷、抗蟲害能力有關。在采收期，S3、S6、S8處理組的土壤中的鈣含量較高，可以為滇重樓生長提供較多的鈣，從而提高滇重樓的抗逆性，且葉中的鈣含量與氮含量具有正相關性。

表7 不同叢枝菌根真菌處理滇重樓莖中元素與土壤元素相關性分析Table 7 The correlation analysis of stem elements and soil elements of P.polyphylla var.yunnanensis

3 討論與結論

接種不同AM真菌菌劑處理能夠不同程度的影響滇重樓及栽培土壤中營養元素的吸收及蓄積。氮、磷、鉀是植物生長發育所必需的元素，其體內含量分布能反映植物對元素的分配及相互作用的關系[21]。接種不同組合AM真菌菌劑后，不同元素的含量在不同生長期呈現動態變化過程，其中S8處理組T1時期新、老根莖和葉，T2時期新根莖和葉以及T4時期新、老根莖中氮的含量增加；S8處理組T1時期新根莖中磷的含量增加(最高為6.289 g/kg)，推測S8處理組的AM真菌可以促進滇重樓吸收土壤中的氮、磷元素來提升產量及品質。與Li等[22]研究一致，增施氮肥和磷肥可增加滇重樓的產量和皂苷含量。S8處理組T4時期老根莖中鉀含量較高，為12.715 g/kg；而且Wang等[23]報道土壤中的鉀有利于滇重樓根莖中總皂苷和多糖的合成與積累，對其影響可能是通過滇重樓不同部位含鉀量來實現。S8處理組T1和T3時期莖和葉以及T4時期新、老根莖的鈣含量增加；T1、T2和T4時期新根莖的鎂的含量增加(最高為28.142 g/kg)。鈣不僅是植物細胞壁和細胞膜等結構的重要組成，還能夠有效緩解各種生物和非生物脅迫對植物的威脅，提高植物抗逆性，對生長發育、成熟及衰老起著重要作用[24]。

藥用植物的品質可以間接反映土壤質量和肥力，根際土壤微生態的變化也會影響藥用植物的質量。AM真菌等微生物的含量能夠引起土壤基質環境的變化，對微生物群落組成結構產生重要影響[25]。本研究發現，除S6、S8處理組滇重樓的新根莖、老根莖和葉中氮的含量顯著升高，S8和S1處理組滇重樓的新根莖的磷含量比其他處理組高(最高可達到6.289 g/kg)之外，不同處理組土壤中的氮、磷、鉀和鎂元素的變化量不大。不同處理組土壤中的鈣含量有顯著性增多，尤其S8處理組的土壤中鈣的含量明顯比對照組高。因此，接種不同叢枝菌根真菌混合菌劑能有效改變滇重樓藥材不同部位氮、磷、鉀、鈣、鎂含量，促進滇重樓對營養元素的吸收。同時也可改變土壤中營養元素的釋放，這與AM真菌菌根對營養物質競爭的優勢作用研究相一致[26]。

相關性分析表明，滇重樓老根莖中N的吸收與Ca、Mg的吸收，新根莖中N的吸收與P、Mg的吸收，P的吸收與K的吸收，葉中的N的吸收和莖中K的吸收與Ca的吸收呈顯著協同作用，老根莖中Ca的吸收與土壤中Ca、Mg的吸收呈顯著負相關作用，莖中的K的吸收與土壤中P的吸收，莖中Mg的吸收與土壤中Mg的吸收呈負相關作用。與Zhang等[11]推測的多種營養元素在滇重樓生長過程中的積累可能存在競爭或協同兩種效應相一致。滇重樓的老根莖中氮、鈣和鎂的吸收三者之間具有協同作用，滇重樓葉中磷的含量隨土壤中鈣含量的增加而增加，而鈣和磷之間存在復雜的交互作用且具有物種特異性，高鈣可增加豆科植物對磷的吸收但抑制小麥、番茄等對磷的吸收[27,28]。

綜上所述，S8處理組的6種AM真菌:微白巨孢囊霉(G.albida)、巨大巨孢囊霉(G.gigantea)、美麗盾巨孢囊霉(S.calospora)、亮色盾巨孢囊霉(R.fulgida)、根內球囊霉(R.intraradices)、近明球囊霉(C.claroideum)作為滇重樓生物菌肥的優良菌種，為生物菌肥的研發奠定基礎。本研究結果顯示9種不同AM真菌菌劑的組合可以不同程度的影響營養元素的含量轉移及蓄積，但是要想篩選最優的混合菌劑還需要進一步的實驗驗證其接種的比例及發酵液的成分等，以期為滇重樓的生物菌肥的研發和應用奠定理論基礎，以利于改變滇重樓營養元素的吸收與蓄積，提升滇重樓的品質。