梔子花提取物的制備工藝優化及其抗氧化活性研究

徐 禎，毛春芹,2，顧 薇,2，毛 靖，蘇聯麟，李 林，皮文霞*，陸兔林,2*

1南京中醫藥大學；2江蘇省中醫外用藥開發與應用工程研究中心，南京 210023

梔子花是茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis和重瓣梔子GardeniajasminoidesEllis var.fortuniana(Lindl.)Hara的干燥花，收錄于《中華本草》[1]《中藥大辭典》[2]等書籍，其味苦、性寒，入藥具有清肺止咳、涼血止血的作用。梔子花食用、藥用、妝用歷史悠久，《滇南本草》[3]言其可“止肺熱咳嗽，止鼻衄血，消痰”；《千金翼方》[4]《本草綱目》[5]均稱其可“悅顏色”。現代研究表明梔子花含有精油、三萜類、黃酮類、酚酸類、生物堿類等多種成分[6-8]。梔子花氣味芳香，從中提取的精油具有舒緩身心、抗焦慮[9]等作用，但因含量少、難以提取而極其珍貴；研究表明梔子花及其精油能夠清除多種自由基[6,10]，具有良好的抗氧化美容效果。黃酮類物質是具有較強抗氧化功效的植物活性成分。梔子花與常用中藥材梔子來源自同一植物，種植廣泛、資源豐富，其提取物目前已收錄于《化妝品已使用原料目錄》2021年版中，但由于研究較少，國內對梔子花的利用率不高，也造成了梔子花資源的大量浪費。

植物精油的傳統提取方法為水蒸氣蒸餾法，這種方法設備簡單，但提取率低，容易導致提取的精油香味不純正[11]。超臨界CO2萃取法[12,13]是一種以CO2流體為溶劑、從混合物中分離出組分的提取方法，這種方法與水蒸氣蒸餾法相比提取效率高，能夠更加有效保存精油的天然香味，且CO2可回收、無毒，不會產生浪費和污染。有文獻報道[12]，采用這種提取方法得到的梔子花精油沒有受到水蒸氣的高溫影響，一些易揮發的芳香成分保留了下來，具有鮮梔子花的特征香氣。除此之外，也有研究[14,15]對梔子花中黃酮類成分的提取工藝進行了考察。由于精油和黃酮都是植物中生物活性較強的大類成分，且應用范圍廣泛，將這兩種成分進行綜合提取在多種中藥和含有精油的植物中已有應用，如紫花地丁[16]、枇杷花[17]、玫瑰[18]、薰衣草[19]等。目前對梔子花精油(Gardeniajasminoidesflower essential oil，GJFEO)或梔子花總黃酮類提取物(Gardeniajasminoidesflower flavonoids extract，GJFFE)的提取均為以梔子花為原料進行單一提取，對梔子花展開綜合性深加工研究、可以提高梔子花的利用率，為中藥非藥用部位資源的開發利用提供參考。

經文獻報道，GJFEO在體外化學實驗中對DPPH、ABTS及OH自由基都有較好的清除作用[6,10]，植物黃酮也是天然抗氧化活性成分研究中的一大熱點[20]。目前梔子花細胞水平和動物水平的抗氧化活性研究較少，對梔子花進行更深入的藥理活性研究可以為相關抗氧化化妝品及日用產品的開發提供技術支持和理論依據。本研究將對梔子花中精油和總黃酮成分的綜合提取工藝進行優化，并對梔子花的抗氧化活性進行研究，以期解決以上問題，并為中藥非藥用部位的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

梔子花購買自浙江溫州，批號20200520，干燥方式為陰干。經南京中醫藥大學藥學院陳建偉教授鑒定為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥花。

蘆丁(上海源葉生物科技有限公司，純度98%，批號YM0313SA14)；沒食子酸對照品(國藥集團化學試劑有限公司，純度99%，批號20200408)；福林酚試劑(國藥集團化學試劑有限公司)；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)(國藥集團化學試劑有限公司)；噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)(美國Sigma-Aldrich公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(上海九億化學試劑有限公司)；DMEM培養基(賽默飛世爾生物化學制品有限公司)；胎牛血清(美國Invigentech公司)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)；無菌PBS(博士德生物科技有限公司)；胰蛋白酶-EDTA消化液(北京索萊寶科技有限公司)；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FW80型高速萬能粉碎機(天津布泰斯特儀器有限公司)；FA1104型電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)；DY221-50-06型超臨界CO2萃取裝置(海安宏麥機械有限公司)；HH-S4型恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司)；TU-1901型雙光束紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；KQ-500E型醫用超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；SW-CJ-1F型潔凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設備有限公司)；3131型二氧化碳培養箱(賽默飛世爾科技有限公司)；細胞培養板(美國 Corning公司)；CKX31型顯微鏡(南京奧力科學儀器有限公司)；Infinite M200PRO型酶標儀(瑞士TECAN公司)。

1.3 細胞株

人永生化角質形成(HaCaT)細胞(上海富衡生物科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 梔子花精油的提取工藝研究

1.4.1.1 單因素試驗

本研究首先采用超臨界CO2流體萃取法對梔子花進行提取，該方法不僅提取率高、經濟環保，且方便梔子花殘渣的進一步提取利用。參數設置參考相關文獻[12]，以精油得率為指標，分別對萃取溫度(30、35、40、45 ℃)、萃取壓力(15、20、25、30、35 MPa)、分離壓力(8、10、12、14 MPa)進行單因素考察。將干梔子花粉碎后過50目篩，取100 g梔子花粉末裝入超臨界流體萃取裝置，設置萃取溫度、萃取壓力、分離壓力，分離溫度為35 ℃，萃取1 h后打開分離釜閥門收集GJFEO。

1.4.1.2 正交試驗

在單因素實驗結果的基礎上，對超臨界CO2萃取法萃取GJFEO的工藝進一步優化，因素水平考察指標如表1所示。

表1 GJFEO提取工藝正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels analysis of orthogonal test of GJFEO extraction process

1.4.2 梔子花總黃酮提取物的提取工藝研究

1.4.2.1 總黃酮標準曲線的繪制

總黃酮的顯色及測定參考文獻方法[14]。精密吸取質量濃度為100.1 μg/mL的蘆丁對照品溶液2.0、2.5、3.0，3.5、4.0、4.5、5.0 mL，分別加入到10 mL容量瓶中，加70%乙醇2 mL，混勻，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，混勻靜置5 min，再加入10%硝酸鋁0.3 mL，混勻靜置6 min，加入4%氫氧化鈉4 mL，混勻靜置15 min，用70%乙醇定容至刻度，搖勻；用同樣的方法制備空白對照。在507 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(Y)，濃度為橫坐標(X)，進行線性回歸。

1.4.2.2 單因素試驗

收集萃取精油后的梔子花粉末殘渣提取其中的總黃酮類物質可提高梔子花的利用率。本研究參考相關文獻[15]，以乙醇為溶劑對梔子花殘渣進行超聲提取，以總黃酮提取率為指標，對乙醇濃度(50%、60%、70%、80%)、液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)、提取時間(20、30、40、50 min)、提取次數(1、2、3次)進行單因素考察，確定GJFFE的最佳提取工藝。GJFFE的提取步驟如下。

稱取提取完精油的梔子花粉末殘渣10 g，加入不同濃度乙醇超聲(功率500 W，頻率40 kHz)提取，合并提取液，過濾后得到濾液，濃縮至50 mL得到梔子花總黃酮提取液，提取液蒸干可得到浸膏，即為GJFFE。GJFFE用50%乙醇溶解后定容至50 mL，參照“1.4.2.1”中總黃酮的顯色方法進行顯色和測定，總黃酮的提取率計算公式見式(1)：

(1)

1.4.3 梔子花復合提取物的制備

將同一份梔子花樣品中所得到的GJFEO和GJFFE稱重，得到兩種提取物的質量比。按照此質量比配制得到梔子花復合提取物(Gardeniajasminoidesflower compound extract，GJFCE)。

1.4.4 梔子花提取物對HaCaT細胞的毒性

取GJFEO、GJFFE、GJFCE，用含1% DMSO的DMEM培養基配制稀釋成不同濃度的藥液。

取對數生長期的HaCaT細胞，稀釋至7×104個/mL后，每孔100 μL接種于96孔板內，在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h；棄舊培養液，以不同濃度的GJFEO(50.00～1 000.00 μg/mL)、GJFFE(50.00～1 000.00 μg/mL)、GJFCE(10.42～833.33 μg/mL)給藥，同時設置空白組、陽性組(SDS濃度為0.01 mg/mL)、調零組，每組設定5個復孔，孵育24 h；棄舊培養液，每孔加入100 μL培養液，避光條件下，每孔再加入20 μL MTT溶液(0.05 mg/mL)，孵育4 h；棄去培養液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶標儀在570 nm處檢測各孔的吸光度A，按式(2)計算各組細胞相對存活率，用Graphpad Prism 7軟件處理數據并計算IC50。

(2)

1.4.5 三種提取物對H2O2誘導的HaCaT細胞氧化損傷的保護作用

按照以下步驟先分別比較GJFEO、GJFFE和GJFCE不同濃度下的抗氧化活性，再選出各自效果最佳的濃度進行比較。

取對數生長期的HaCaT細胞，稀釋至7×104個/mL后，每孔100 μL接種于96孔板內，孵育24 h；棄去舊培養液，以不同濃度的GJFEO(12.50～100.00 μg/mL)、GJFFE(20.00～320.00 μg/mL)、GJFCE(2.09～133.44 μg/mL)給藥，同時設置空白組、陽性組(Vc濃度為0.008 mg/mL)、模型組、調零組，每組設定5個復孔，孵育24 h；除空白組和調零組外，每孔加50 μL H2O2(終濃度0.8 mmol/L)，孵育4 h；棄去舊培養液，每孔加入100 μL培養液，避光條件下，每孔再加入20 μL MTT溶液，孵育4 h；棄去培養液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶標儀在570 nm處檢測各孔的吸光度A，按式(2)計算各組細胞相對存活率。

2 結果與分析

2.1 GJFEO的提取工藝研究

2.1.1 萃取溫度對GJFEO得率的影響

設置萃取壓力為20 MPa，分離壓力為10 MPa，在30～45 ℃范圍內考察萃取溫度對梔子花精油得率的影響。由圖1A可知，精油得率隨著萃取溫度變化而變化，當萃取溫度在30～40 ℃之間時，精油得率較高，萃取溫度為40 ℃，最高可達0.81%；此時萃取溫度再升高，精油得率反而下降。原因可能為恒定壓力下，CO2密度隨溫度的升高而降低，而溫度對溶質的溶解度同樣具有一定影響。這種影響程度除實驗外目前還不可預測[21]。因此根據本研究結果，確定40 ℃為最佳萃取溫度。

2.1.2 萃取壓力對GJFEO得率的影響

設置萃取溫度為45 ℃，分離壓力為10 MPa，在15～35 MPa范圍內考察萃取壓力對梔子花精油得率的影響。由圖1B可知，精油得率隨萃取壓力的增大有升高趨勢，當萃取壓力為30 MPa時最高，達到了1.14%，此時繼續增大萃取壓力，精油得率則會開始下降，原因可能是超臨界狀態下，壓力和溫度對萃取效果產生的交互影響較大。大多數情況下，隨壓力的增大，脂溶性物質的提取率會相應升高，但速率會減慢；且溶出的物質種類會增加。在超臨界流體萃取法中，萃取的效果往往取決于萃取壓力和溫度的共同作用，其中萃取壓力產生的影響更大[21]。根據本實驗結果，選擇30 MPa為最佳萃取壓力。

2.1.3 分離壓力對GJFEO得率的影響

當流體狀的CO2攜帶精油進入分離釜時，壓力降低使得CO2與精油分離。設置萃取溫度為45 ℃，萃取壓力為20 MPa，在8～14 MPa范圍內考察分離壓力對GJFEO得率的影響。由圖1C可知，GJFEO的得率隨著分離壓力的升高而升高。當分離壓力為14 MPa時，精油得率最高，為1.06%，因此選擇14 MPa為最佳分離壓力。

圖1 GJFEO提取工藝的單因素考察Fig.1 Single factors investigation of GJFEO extraction process

2.1.4 正交試驗結果

根據單因素考察的結果設置正交試驗的因素水平，對GJFEO的提取工藝進行進一步的優化。正交試驗結果和方差分析如表2、3所示，由此可知，在本研究中，萃取溫度對梔子花精油得率的影響最大，其次是萃取壓力，分離壓力的影響最小。因此超臨界流體萃取法提取GJFEO的最佳工藝根據實驗結果選擇萃取溫度為38 ℃，萃取壓力為32 MPa，分離壓力則選擇能耗較少的12 MPa。

表2 GJFEO提取工藝的正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results of GJFEO extraction process

2.2 GJFFE的提取工藝研究

2.2.1 總黃酮標準曲線的繪制

在507 nm波長處測定不同濃度蘆丁對照品溶液顯色后的吸光度，以吸光度為縱坐標(Y)，濃度為橫坐標(X)，進行線性回歸，回歸方程為Y= 13.487X- 0.109 4，r= 0.999 6，表明總黃酮在20.02 ～ 50.05 μg/mL范圍內線性關系良好。

表3 GJFEO提取工藝正交試驗方差分析Table 3 The analysis of variance of orthogonal test of GJFEO extraction process

2.2.2 乙醇濃度對GJFFE提取的影響

將提取完精油的梔子花分別用50%、60%、70%、80%的乙醇，按液料比20∶1進行提取，每次30 min，共提取2次，測定并計算總黃酮的提取率。結果如圖2A所示，梔子花殘渣中總黃酮的提取率隨著乙醇濃度的升高而降低，說明較低濃度的乙醇有利于黃酮類成分的溶出。根據本實驗結果，選擇50%為最佳乙醇濃度。

2.2.3 液料比對GJFFE提取的影響

將提取完精油的梔子花用60%乙醇，分別按液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1進行提取，每次30 min，共提取2次，測定并計算總黃酮的提取率。結果如圖2B所示，梔子花殘渣中總黃酮的提取率隨著液料比的增大而緩慢升高，說明在10∶1～25∶1的液料比范圍內，液料比對梔子花殘渣中總黃酮成分提取的影響不大。根據本實驗結果，選擇25∶1為最佳液料比。

2.2.4 提取時間對GJFFE提取的影響

將提取完精油的梔子花用60%乙醇，按液料比20∶1進行提取，提取時間分別為每次20、30、40、50 min，共提取2次，測定并計算總黃酮的提取率。結果如圖2C所示，梔子花殘渣中總黃酮的提取率隨著每次提取時間的增長而升高，當提取時間為50 min時提取效果最好，此時總黃酮提取率2.05%。因此選擇50 min為每次的提取時間。

2.2.5 提取次數對GJFFE提取的影響

將提取完精油的梔子花分別用60%乙醇，按液料比20∶1進行提取，每次30 min，各提取1、2、3次，測定并計算總黃酮的提取率。結果如圖2D所示，梔子花殘渣中總黃酮的提取率隨著提取次數的增大而升高，提取2次的提取率比提取1次顯著升高，但當提取次數為3次時，升高幅度不大，為提高效率節約能源，選擇提取次數為2次。

圖2 GJFFE提取工藝的單因素考察Fig.2 Single factors investigation of GJFFE extraction process

2.3 梔子花復合提取物的制備

在同一份梔子花樣品中提取得到的GJFEO質量為1.07 g、GJFFE質量為23.79 g，質量比約為1∶24。將GJFEO和GJFFE按照此比例進行復配可以最大程度地利用兩種提取物。因此從提高梔子花原料利用度的角度出發，將GJFEO和GJFFE按質量比1∶24復配制得GJFCE。

2.4 梔子花提取物對HaCaT細胞的毒性

角質形成細胞是人類表皮組織中最主要的細胞群，占95%。HaCaT細胞是研究外用藥物制劑及化妝品對皮膚安全性及有效性時的首選細胞。SDS是一種陰離子表面活性劑，運用于化妝品、日化用品中，對人體有微毒，常被用于測定皮膚刺激性的實驗。以SDS為陽性藥，采用MTT法分別測定給藥后的細胞相對存活率，以IC50的大小來反映梔子花精油、梔子花黃酮提取物和復合提取物的對HaCaT細胞的毒性，結果見圖3。由結果可知，梔子花精油和黃酮提取物對皮膚細胞的毒性較小，但二者按比例復配后毒性顯著增大。

2.5 梔子花提取物對H2O2誘導的HaCaT細胞氧化損傷的保護作用

氧化損傷是公認的造成皮膚衰老的主要原因之一。H2O2是一種活性氧，具有強氧化性，使用H2O2作為誘導劑可以模擬出較為真實的皮膚氧化損傷情況。抗壞血酸(Vc)是常用的抗氧化劑，0.008 mg/mL即可發揮作用，且作用較顯著。首先考察不同濃度下的GJFEO、GJFFE的抗氧化活性，分別篩選出效果最好的濃度后和GJFCE進行比較，結果如圖4A、4B所示。可知當濃度在12.50～50.00 μg/mL之間時，GJFEO組和模型組相比具有顯著的抗氧化作用(P<0.01)，且效果優于Vc組；當濃度在20.00～160.00 μg/mL之間時，GJFFE組和模型組相比具有抗氧化作用，當濃度為20 μg/mL時，具有顯著的抗氧化活性(P<0.001)且效果優于Vc組。細胞的相對存活率隨著GJFEO和GJFFE的濃度升高而降低，原因是這兩種提取物均具有一定的細胞毒性，濃度升高，細胞毒性也增大。由圖4C可知，當濃度在2.09～16.68 μg/mL范圍內，GJFCE組和模型組相比具有顯著的抗氧化活性(P<0.05)，且優于Vc組。GJFCE組發揮抗氧化活性的濃度明顯低于GJFEO組和GJFFE組，當濃度為4.17 μg/mL時，GJFCE組抗氧化活性最佳。

根據實驗結果篩選，GJFEO、GJFFE和GJFCE抗氧化效果最好的濃度分別為25、20、4.17 μg/mL。將這三種效果最好濃度的提取物進行比較，結果如圖4D顯示，4.17 μg/mL的GJFCE的抗氧化效果優于單一使用的GJFEO或GJFFE(P<0.001)，且此時GJFCE中的GJFEO、GJFFE的占比濃度僅為0.17、4.00 μg/mL，遠低于此組實驗中兩種單一提取物的濃度，因此表明將GJFEO和GJFFE按比例復配后可明顯提高抗氧化活性。

圖4 梔子花不同提取物抗H2O2誘導的HaCaT細胞氧化損傷保護作用比較Fig.4 The protective effect of different extracts from Gardenia jasminoides flower against oxidative damage induced by H2O2 in HaCaT cells注：與空白組比較， ***P<0.001；與模型組相比，與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與GJFCE組相比，△△△P<0.001。 Note:Compared with the blank group, ***P<0.001;Compared with the model group, #P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;Compared with the GJFCE group,△△△P<0.001.

實驗結果表明，GJFEO、GJFFE復配后細胞毒性增大，抗氧化作用明顯增強，二者可能是產生了協同增效作用。Zhu等[16]對紫花地丁的相關研究同樣發現其揮發油和黃酮類成分在清除DPPH自由基上能產生協同作用，但機制尚不明確。植物精油發揮抗氧化作用的機制主要為降低自由基水平和調控影響細胞凋亡的蛋白基因兩個方面[22]，如薰衣草精油[23]、花椒精油[24]可抑制或清除體內多種自由基、提高超氧化物歧化酶(SOD)活性、調節抑制細胞凋亡的多種蛋白基因等。植物黃酮抑制機體脂質過氧化的機制和精油相似[25]，如楊梅黃酮[26]可以提高SOD活性，提高IKBA mRNA表達量、抑制MMP-1 mRNA水平的升高；葛根素[27]對UVA損傷的HaCaT細胞的保護作用可能與激活Keap1/Nrf2信號通路上調抗氧化酶活性和下調IL-1β、Fas有關；補骨脂異黃酮[28]同樣可能通過下調相關蛋白表達、提高抗氧化酶活性來保護皮膚細胞。綜上所述，植物精油和黃酮都是通過提高抗氧化酶的活性、調控抑制細胞凋亡的蛋白基因等方式來發揮抗氧化作用，二者作用途徑高度相似，可能是其復合時發揮協同增效作用的機制之一。GJFCE的抗氧化活性增強的同時其細胞毒性也相應升高，但其產生明顯抗氧化活性的濃度在其IC50范圍內，表明GJFCE在發揮抗氧化作用時對細胞的損傷仍然較小。

3 結論

本研究采用單因素和正交試驗優化了GJFEO的最佳提取工藝為萃取溫度38 ℃、萃取壓力32 MPa、分離壓力12 MPa；采用單因素試驗優化了GJFFE的最佳提取工藝為乙醇濃度50%、液料比25∶1、提取時間50 min、共提取2次。兩種工藝均條件簡單、操作方便，一方面避免了精油傳統提取過程中加熱的操作，克服了蒸餾法精油香味不純正、提取率低的缺陷；另一方面對提取完精油的殘渣進行再次提取，能夠獲得其中的總黃酮成分，提高了梔子花原料的利用率。

本研究的實驗結果表明，GJFEO、GJFFE、GJFCE均對H2O2損傷的HaCaT細胞有一定的保護作用，且GJFEO與GJFFE復合后能夠產生協同增效的作用，提示GJFCE可作為一種高抗氧化性的梔子花提取物進行開發或深入的機制研究。根據實驗中GJFEO和GJFFE在梔子花中所占質量比為1∶24，本文中研究的GJFCE從提高原料利用率的角度考慮按照此比例進行復配，后期可對不同比例復配的GJFCE進行進一步的活性評價以優選最佳比例。目前由于開發技術的薄弱，梔子花資源存在大量浪費，本研究的結果可為梔子花相關抗氧化化妝品及日化用品的開發提供技術支持和理論依據，為中藥非藥用部位的綜合利用提供借鑒及參考。