基于斑馬魚模型的竹柳多糖對感覺毛細胞保護活性的研究

孫 晨，高 燕，巴帥康，秦子臻，張 云，張姍姍*，劉可春*

1齊魯工業大學(山東省科學院)生物研究所，濟南 250103；2云南大學生命科學學院，昆明 650500

氨基糖苷類藥物是化學結構中含有氨基糖分子的抗生素，多用于治療革蘭氏陰性菌的感染，應用十分廣泛[1]。但是這類藥物具有較強的耳毒性和腎毒性[2]。研究發現，其腎毒性可通過水化治療來緩解[3]。但是其耳毒性目前卻無有效的治療方法，開發相應的防治藥物至關重要。氨基糖苷類藥源性耳聾的致病機理目前尚未完全研究清楚，但是已有研究發現，內耳中的感覺毛細胞在其中發揮著關鍵作用[4]。該細胞是位于哺乳動物內耳中的一類終末分化細胞，一旦缺失不可再生。氨基糖苷類藥物進入毛細胞后，可誘導活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量產生[5]。這些由于氨基糖苷類藥物作用而產生的ROS可促使毛細胞發生氧化損傷，并誘導其凋亡[6]。因此，降低感覺毛細胞內ROS的產生現已成為氨基糖苷類藥源性耳聾防治藥物研發的方向之一。斑馬魚是一種國際認可的新型脊椎動物模式生物，體積較小、生長快速、生殖能力強、體外受精發育、胚胎透明，在生理結構、信號通路、蛋白質功能等方面，斑馬魚與人類相比均表現出極高的保守性[7]。斑馬魚具有與人類高度同源的內耳感覺毛細胞及側線毛細胞。當其發育至第5天(days post-fertilization，dpf)時，上述毛細胞既已發育完全[8]。由于斑馬魚在發育早期全身透明，借助活體成像技術，可直接實時觀察待測樣品對毛細胞的毒性作用。因此，斑馬魚現已成為研究藥源性耳聾防治藥物的重要模式生物。在前期的研究中發現，竹柳中含有一種具有抗氧化功效的多糖，其組成為：8.72%木糖、14.87%L(+)-鼠李糖、3.22%D(-)-葡萄糖醛酸、5.45%D-半乳糖醛酸、54.68%D-阿拉伯糖、13.05%甘露糖(見附錄1)。基于抗氧化與感覺毛細胞損傷保護的密切聯系，本實驗選用斑馬魚為試驗動物，氨基糖苷類代表性抗生素——卡那霉素為損傷藥物，以自主發現的竹柳多糖為實際研究對象，對其感覺毛細胞的保護活性與機制進行了初步研究，旨在為進一步理解藥源性耳聾的防治提供理論依據與實驗數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗采用健康野生AB系斑馬魚，由山東省人類疾病斑馬魚模型與藥物篩選工程技術研究中心提供。雌雄斑馬魚在28 ℃，光照與黑暗時間為14 h和10 h條件下分開養殖。交配取卵時，于前日將健康成熟斑馬魚按雌雄比1∶1或1∶2比例放入交配缸內，中間放置隔板，置于黑暗環境中，次日亮燈前抽去隔板，光照刺激使其排卵。

1.2 實驗藥品、儀器與試劑

造模藥物卡那霉素(批號：BA10BA0024，生工生物工程(上海)股份有限公司)，用去離子水配制成1 mM的儲蓄液，放置于-20 ℃保存。4%多聚甲醛(批號：AR1069，武漢博士德生物公司)；CellROX Deep Red試劑盒(批號：2023824，Thermo Fisher Scientific)；TUNEL Brightred Appoptosis Detection Kit(批號：A113，南京諾唯贊生物科技有限公司)；FM1-43染料(批號：#70020，Biotium)；三卡因(批號：886-86-2，Sigma-Aldrich)。

AXIO Zoom.V16蔡司體式熒光顯微鏡(卡爾蔡司，德國)；OLYMPUS熒光顯微鏡觀察并拍照(OLYMPUS，日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 竹柳多糖的安全性評價

受精3 h(hours post-fertilization，hpf)的斑馬魚胚胎分別暴露于0、30、40和50 μg/mL的竹柳多糖藥液中，在28.5 ℃的培養箱中連續處理96 h，期間每24 h更換一次藥液，每個濃度同時設置三個平行組(每個濃度20個胚胎)。處理結束后，對斑馬魚進行形態觀察并統計各組的累計死亡率、累計孵化率、畸形率及心率。累計死亡率=(96 hpf的死亡數/胚胎總數)×100%；累計孵化率=(96 hpf孵化數/96 hpf存活的胚胎總數)×100%；畸形率=(96 hpf畸形數/96 hpf已孵化幼魚數)×100%；畸形指標為脊柱和尾巴彎曲、卵黃囊畸形、心包水腫和生長發育遲緩[9]。

1.3.2 卡那霉素與竹柳多糖的聯合毒性評價

受精6 dpf的斑馬魚置于24孔細胞培養板中，隨機分成空白對照組與不同濃度聯合暴露組，分別為a：空白對照組、c：30 μg/mL竹柳多糖+卡那霉素組、d：40 μg/mL竹柳多糖+卡那霉素組、e：50 μg/mL竹柳多糖+卡那霉素組，每組15尾仔魚，同時設置三個平行孔?？瞻讓φ战M中不添加任何待測物；不同濃度聯合暴露組中分別同時添加200 μM的卡那霉素與30、40、50 μg/mL的竹柳多糖藥液，上述各組斑馬魚均置于28.5 ℃的培養箱中連續處理2 h。處理結束后，對斑馬魚進行形態觀察并統計各組的累計死亡率、累計孵化率、畸形率和心率。

1.3.3 竹柳多糖對功能型毛細胞的保護活性評價

受精6 dpf的斑馬魚隨機分成空白對照組、造模組和不同濃度的竹柳多糖處理組分別為a：空白對照組、b：卡那霉素造模組、c：30 μg/mL竹柳多糖+卡那霉素組、d：40 μg/mL竹柳多糖+卡那霉素組、e：50 μg/mL竹柳多糖+卡那霉素組?？瞻讓φ战M內不添加任何待測物，置于28.5 ℃的培養箱中連續處理1 h。造模組中添加終濃度為200 μΜ的卡那霉素，置于28.5 ℃的培養箱中連續處理1 h。不同濃度竹柳多糖處理組中首先分別添加終濃度為30、40、50 μg/mL的竹柳多糖，置于28.5 ℃的培養箱中預處理1 h，隨后加入終濃度為200 μΜ的卡那霉素，在28.5 ℃的培養箱中繼續處理1 h。處理結束后，將上述各組仔魚置于5 μM 的FM1-43染料中，避光孵育3 min。隨后使用麻醉劑將仔魚麻醉，熒光顯微鏡下觀察計數耳石附近5簇功能型毛細胞(O1、MI1、MI2、O2和IO4)的數量(n=15)[10]。

1.3.4 感覺毛細胞內ROS含量檢測

受精6 dpf的斑馬魚如“1.3.3”所述方法處理后，應用CellROX Deep Red試劑盒，對感覺毛細胞內的ROS進行熒光標記，操作方法參照試劑盒說明。標記結束后，清洗各組仔魚，熒光顯微鏡下觀察拍攝耳石周圍被標記為紅色熒光的ROS。

1.3.5 凋亡感覺毛細胞檢測

受精6 dpf的斑馬魚如“1.3.3”所述方法處理后，應用TUNEL BrightRed凋亡檢測試劑盒，對發生凋亡的感覺毛細胞進行特異標記，操作方法參照試劑盒說明。標記結束后，清洗各組仔魚，熒光顯微鏡下觀察拍攝耳石周圍被標記為紅色熒光的凋亡毛細胞。

1.4 統計分析

使用GraphPad Prim version 6軟件對數據進行t檢驗和單因素方差分析，數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，P<0.05代表差異顯著。

2 結果

2.1 竹柳多糖對斑馬魚一般指標的影響

不同濃度竹柳多糖連續作用斑馬魚胚胎96 h后，如圖1所示，空白對照組內無胚胎畸形情況發生，其累計死亡率、孵化率分別為2.50%±1.44%、97.40%±0.03%，心率為198.60±2.27(見表1)。30、40和50 μg/mL的竹柳多糖連續處理斑馬魚96 h后，亦無胚胎畸形情況發生，其死亡率分別為2.50%±2.50%、10.00%±3.82%、5.83%±2.21%，孵化率分別為100.00%、98.04%±1.96%、99.07%±0.93%，心率分別為198.90±1.59、198.30±2.15、205.35±2.00(見圖1、表1)。不同濃度竹柳多糖處理組在死亡率、孵化率和心率等方面與空白對照組相比，均無顯著性差異。上述結果提示，當竹柳多糖的作用濃度為30、40、50 μg/mL時，它對斑馬魚沒有明顯的毒性作用。

圖1 竹柳多糖的安全性評價Fig.1 Safety evaluation of bamboo willow polysaccharides注：A：竹柳多糖連續作用96 h后斑馬魚的累計死亡率；B：竹柳多糖連續作用96 h后斑馬魚的累計孵化率；C：竹柳多糖連續作用96 h后斑馬魚的形態。Note:A:Cumulative mortality of zebrafish after 96 h continuous treatment with bamboo willow polysaccharides;B:Cumulative hatching rate of zebrafish after 96 h continuous treatment with bamboo willow polysaccharides;C:Morphology of zebrafish after continuous treatment with bamboo willow polysaccharides for 96 h.

表1 96 hpf幼魚每分鐘心率Table 1 Zebrafish heart rate per minute of 96 hpf = 20)

2.2 竹柳多糖與卡那霉素共處作用后對斑馬魚心率及形態的影響

不同濃度竹柳多糖與卡那霉素共同作用6 dpf斑馬魚2 h后，各組斑馬魚均發育正常，且無死亡現象，如圖2所示。在空白對照組中，斑馬魚的平均心率為195.80±3.28；在30、40和50 μg/mL的聯合暴露組中，斑馬魚的心率分別為193.70±2.27、197.00±2.86、197.30±1.95(見表2)。不同濃度聯合暴露組的斑馬魚心率與空白對照組相比，均無統計學差異。上述結果提示，當竹柳多糖的作用濃度為30、40、50 μg/mL時，它與200 μM的卡那霉素聯合作用斑馬魚后，不具有明顯的聯合毒性。

圖2 竹柳多糖與卡那霉素的聯合毒性評價Fig.2 Evaluation of joint toxicity of bamboo willow polysaccharides and kanamycin注：不同濃度竹柳多糖與卡那霉素聯合作用后，斑馬魚形態發育正常，脊柱與尾巴均無彎曲、卵黃囊無畸形、心包無水腫(a：空白對照組；c：30 μg/mL竹柳多糖+卡那霉素組；d：40 μg/mL竹柳多糖+卡那霉素組；e：50 μg/mL竹柳多糖+卡那霉素組)。Note:Morphology of zebrafish treated with kanamycin and polysaccharides (a:Control;c:30 μg/mL bamboo willow polysaccharides+kanamycin;d:40 μg/mL bamboo willow polysaccharides+kanamycin;e:50 μg/mL bamboo willow polysaccharides+kanamycin).

表2 斑馬魚每分鐘心率Table 2 Zebrafish heart rate per minute = 15)

2.3 竹柳多糖對卡那霉素誘導的感覺毛細胞損傷的影響

FM1-43是一種特異的熒光染料，它可以通過感覺毛細胞上的機械感知通道進入胞內[11]。機械感知通道是一種機械敏感的離子通道，它可將聲波的機械振動轉化為電信號，是感覺毛細胞行使聽覺功能的關鍵[12]。為了明確竹柳多糖對卡那霉素誘導的感覺毛細胞損傷是否具有保護功效，應用FM1-43對功能型的感覺毛細胞進行了特異標記，結果如圖3所示。在空白對照組中，斑馬魚側線處的感覺毛細胞均被特異標記，其耳石周圍5簇功能型毛細胞的平均數量為48.64±4.17。但是當濃度為200 μM的卡那霉素連續作用斑馬魚1 h后，其側線處功能型毛細胞的數量明顯減少，與空白對照組相比具有明顯的統計學差異。當30、40、50 μg/mL的竹柳多糖與卡那霉素共同作用時，與卡那霉素處理組相比，毛細胞數量顯著增加，且毛細胞的數量與竹柳多糖的作用濃度呈正相關性(見圖3、表3)。上述結果提示，竹柳多糖對卡那霉素誘導的感覺毛細胞損傷具有一定的保護活性。

表3 各組斑馬魚耳石周圍五簇功能型毛細胞的數量Table 3 Numbers of five clusters of functional hair cells around otoliths in zebrafish in each group = 15)

圖3 竹柳多糖對感覺毛細胞的保護功效Fig.3 Protective effect of bamboo willow polysaccharides on sensory hair cells注：A：被特異標記的功能型毛細胞(a：空白對照組；b：卡那霉素造模組；c：30 μg/mL竹柳多糖+卡那霉素組；d：40 μg/mL竹柳多糖+卡那霉素組；e：50 μg/mL竹柳多糖+卡那霉素組，下同)；B：各組斑馬魚耳石周圍五簇功能型毛細胞的數量統計。紅色方框：耳石周圍的五簇毛細胞；###卡那霉素造模組vs空白對照組，P<0.001；***竹柳多糖處理組vs卡那霉素造模組，P<0.001)。Note:A Functional hair cells that are specifically labeled(a:Control;b:kanamycin;c:30 μg/mL bamboo willow polysaccharides+kanamycin;d:40 μg/mL bamboo willow polysaccharides+kanamycin;e:50 μg/mL bamboo willow polysaccharides+kanamycin,the same below);B Numbers of five clusters of functional hair cells around the otolith of zebrafish in each group.Red box:five clusters of hair cells around the otolith;###Kanamycin vs control,P<0.001; ***Bamboo willow polysaccharides vs kanamycin,P<0.001).

2.4 竹柳多糖對卡那霉素誘導的ROS積聚的影響

由于ROS的過量積聚在卡那霉素誘導感覺毛細胞損傷中起著重要作用，因此為了明確竹柳多糖的感覺毛細胞保護機制，對毛細胞內的ROS含量進行了檢測。結果發現，與空白對照組相比，200 μM的卡那霉素可導致毛細胞內ROS水平的升高，但是當30、40、50 μg/mL的柳多糖與卡那霉素共同作用時，毛細胞內的ROS含量明顯減少(見圖4)。

圖4 感覺毛細胞內ROS檢測Fig.4 Detection of ROS in sensory hair cells注：白色箭頭：被紅色熒光標記的ROS。Note:The white arrows:ROS in sensory hair cells were labeled by red fluorescence.

上述結果提示，竹柳多糖有效抑制了感覺毛細胞中卡那霉素誘導的ROS的積聚。

2.5 竹柳多糖對卡那霉素引起的感覺毛細胞凋亡的影響

為了進一步明確竹柳多糖的感覺毛細胞保護機制，對毛細胞的凋亡進行了檢測。如圖5所示，與空白對照相比，200 μM卡那霉素連續作用斑馬魚1 h后，毛細胞的凋亡發生率明顯增加。但是當30、40或50 μg/mL的竹柳多糖與卡那霉素共同作用時，與卡那霉素單獨處理組相比，發生凋亡的毛細胞明顯減少。上述結果提示，竹柳多糖抑制了卡那霉素誘導的感覺毛細胞凋亡的發生。

圖5 感覺毛細胞凋亡檢測Fig.5 TUNEL assay of sensory hair cells注：白色箭頭：發生凋亡的毛細胞。Note:The white arrow:Apoptotic cells were marked as red dots.

3 討論與結論

卡那霉素作為氨基糖苷類抗生素的代表藥物之一，價格低廉、抗菌譜廣，性質穩定，應用十分廣泛[13]。但是它卻具有較強的耳毒性[14]?？敲顾刂旅@的作用機制比較復雜，內耳感覺毛細胞內ROS的過量積聚在其中發揮著重要作用，而抗氧化劑則可在一定程度上防治卡那霉素引起的感覺毛細胞損傷[15]?；诖?，本項目以自主發現的具有抗氧化活性的竹柳多糖作為研究對象，應用斑馬魚模型對其感覺毛細胞保護活性進行了初步研究。

研究發現，當30、40或50 μg/mL的竹柳多糖單獨作用于斑馬魚后，斑馬魚的累計孵化率均高于98%，累計死亡率均低于15%，心率均在每分鐘198～210次之間。雖然在40 μg/mL的處理組中，斑馬魚的累計死亡率略高，但是經過統計學檢測后發現，上述三組斑馬魚(30、40、50 μg/mL)的累計孵化率、死亡率以及心率與空白對照組相比，均無統計學差異。該結果提示，竹柳多糖對斑馬魚無明顯毒性或致畸作用。進一步的研究發現，竹柳多糖與卡那霉素共同作用時，對斑馬魚亦無明顯的毒性或致畸作用。但是在此濃度下，該多糖對卡那霉素誘導的感覺毛細胞損傷卻具有明顯的保護活性，且可有效減少毛細胞內卡那霉素誘導的ROS的積聚，并抑制毛細胞凋亡的發生。ROS作為機體內一類氧的單電子還原產物，是電子從呼吸鏈中泄露，并消耗約2%的氧氣后生成的[16]。機體內部的ROS并不總是有害的。適量ROS可促進修復、免疫、生長和存活等[17]。但是在病理條件下，ROS產生與清除的動態平衡會發生紊亂，ROS長時間的過量積聚往往會對蛋白質、核酸、多糖和脂質等生物大分子造成傷害，使細胞處于氧化應激狀態，并誘導其凋亡[15]。本研究發現，在體外具有抗氧化活性的竹柳多糖亦可在感覺毛細胞內發揮其抗氧化功效。該多糖可通過降低感覺毛細胞內ROS的含量，緩解其氧化損傷程度，并最終抑制卡那霉素誘導的凋亡的發生，對毛細胞起到保護作用。又由于該多糖不具有明顯的毒性或致畸作用，因此上述結果提示，竹柳多糖在聽覺保護領域具有一定的應用潛能。

天然產物來源的多糖是一類結構復雜的高分子化合物。大量研究已證實，多糖通常具有抗氧化活性[18]，且該活性與多糖中甘露糖、半乳糖和糖醛酸的含量密切相關[19]。例如甘露糖、半乳糖和糖醛酸等均易與ROS相互作用，進而使糖苷鍵發生裂解或使糖醛酸氧化。本研究所用竹柳多糖含有約13.05%的甘露糖，3.22%的葡萄糖醛酸及5.45%的D-半乳糖醛酸。由此推測，竹柳多糖的感覺毛細胞保護活性可能是由其單糖組成決定的。竹柳多糖內的甘露糖與糖醛酸均有助于其快速降低感覺毛細胞內的ROS含量，進而起到感覺毛細胞保護活性。

竹柳生長迅速、抗逆性強、經濟效益高、適應性強、近年來在我國的種植面積迅速擴大[20]。目前對于竹柳的研究主要集中在抗旱，耐鹽堿，病蟲害防治等領域[21]，而對其提取物功效的研究鮮有報道。本研究通過在體實驗，證實竹柳多糖對氨基糖苷類抗生素誘導的感覺毛細胞損傷具有一定的保護活性，并發現該保護活性與竹柳多糖的抗氧化性密切相關。本研究所得數據可為藥源性耳聾的防治提供新的實驗數據，并有助于拓寬竹柳的應用領域，促進其高值化應用。