柑橘黃酮對胰蛋白酶活性的抑制及作用機制初探

李繼偉，柯 奧，李煒瑋，邱士文，顏 靖

武漢設計工程學院食品與生物科技學院，武漢 430205

柑橘皮渣是柑橘加工的主要副產物，約占全果的30%～50%[1]，常被用來制成飼料或直接丟棄。皮渣中富含膳食纖維、黃酮類化合物等功能成分，對其進行開發利用有利于提高企業效益和保護環境[2,3]。

胰蛋白酶是一種人和動物體內重要的消化酶，能激活其他消化酶原，在新陳代謝過程中發揮著重要的作用[4]。同時，多種疾病(胰腺炎、肺氣腫、腦水腫、癌癥等)的發生均與胰蛋白酶的過量分泌有關，臨床上常使用胰蛋白酶抑制劑類藥物來進行治療[5-7]。

研究表明，一些植物多酚類化合物對胰蛋白酶表現出一定的抑制作用，如紫甘薯花色苷對胰蛋白酶的催化活性表現出明顯的抑制作用，使胰蛋白酶內源熒光發生靜態猝滅，且二者之間通過氫鍵和范德華力相互作用[8]；槲皮素、蘆丁、橙皮素、蕓香葉苷、漆黃素等均具有不同程度的胰蛋白酶抑制作用[4,9]；雪菊中一種黃酮類化合物可以抑制胰蛋白酶的活性，減輕小鼠酒精性急性胰腺炎的損傷[10]。柑橘黃酮提取物作為常見的保健品功能成分，其對胰蛋白酶活性的影響尚不清楚，本文以Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽酸鹽(N-α-benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride，BAPNA)為底物，研究了柑橘黃酮對胰蛋白酶活性的影響及其抑制類型，并通過熒光光譜法研究了柑橘黃酮與胰蛋白酶的作用機制，以期為柑橘黃酮特膳食品、保健食品的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柑橘黃酮(黃酮含量≥60%)，西安森冉生物工程有限公司；牛胰蛋白酶(>180 U/mg)，上海金穗生物科技有限公司；柚皮苷(≥95%)和Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽酸鹽(BAPNA，≥98%，HPLC)，上海源葉生物科技有限公司。對硝基苯胺等其他試劑均為國產分析純。

RF-6000熒光分光光度計，日本島津公司；EL104型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-S2型恒溫水浴鍋，上海暉創化學儀器有限公司；722型分光光度計，上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 胰蛋白酶酶活的測定方法

1.2.1.1 最佳吸收波長的選擇

為了減少反應體系背景(黃酮)對酶促反應產物吸光值測定的干擾，分別對酶促反應體系中的反應產物(5 μg/mL對硝基苯胺)和背景(0.66 mg/mL的黃酮和0.5 mg/mL的BAPNA底物)進行波長掃描，并通過產物和背景吸光度的比值來確定最適的產物測定波長。

1.2.1.2 胰蛋白酶活力的測定

對硝基苯胺(產物)標曲的測定：分別取50 μg/mL對硝基苯胺0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于8個比色管中，加入0.05 mol/L pH 8.0的磷酸緩沖液(PB)至2.8 mL，于37 ℃處理5 min，立即加入33%的醋酸0.5 mL，搖勻，以空白管做參比測定420 nm下的吸光值。獲得對硝基苯胺標曲y=0.016 5x-0.011 8，R2=0.999 9，式中y為A420，x為反應體系中對硝基苯胺的質量(μg)。

蛋白酶活力的測定[5,11,12]：以BAPNA為底物，取0.4 mL PB(pH 8.0)和0.4 mL胰蛋白酶(0.5 mg/mL)，再加入2 mL 0.5 mg/mL的BAPNA溶液(pH 8.0 的PB配制)，在37 ℃下反應5 min后，加入33%醋酸溶液0.5 mL終止反應，測定420 nm下的吸光值，根據公式(1)計算酶促反應速度v(μg/min)。

(1)

式中v表示酶促反應速度μg/min，A表示OD420下測定的吸光值，T表示反應時間5 min，n表示稀釋倍數。

1.2.2 不同溫度下柑橘黃酮對胰蛋白酶抑制作用的研究

參考文獻方法[13]并適當修改，設定不同溫度(27、37和47 ℃)，按“1.2.1.2”蛋白酶活性測定體系研究不同濃度的柑橘黃酮溶液(0.05、0.08、0.18、0.33、0.66 mg/mL)對胰蛋白酶的抑制作用，經酶促反應后，測定420 nm下的吸光值：試驗組(A1)為0.4 mL柑橘黃酮溶液+0.4 mL胰蛋白酶+2 mL BAPNA；空白對照組(A2)為0.4 mL PB+0.4 mL胰蛋白酶+2 mL BAPNA；試驗組背景(A3)為0.4 mL柑橘黃酮溶液+0.4 mL PB+2 mL BAPNA；對照組背景(A4)為0.8 mL PB+2 mL BAPNA。實驗重復3次，結果用“平均值±標準差”表示。

根據公式(2)計算柑橘黃酮對胰蛋白酶活性的抑制率。

(2)

1.2.3 柑橘黃酮對胰蛋白酶抑制類型的研究[14,15]

可逆/不可逆抑制的判斷：保持“1.2.1.2”蛋白酶活性測定體系中的底物BAPNA濃度(0.5 mg/mL)不變，在不同黃酮濃度(0、0.33、0.66 mg/mL)下，改變胰蛋白酶的濃度(0.125、0.25、0.75、1.25 mg/mL)，測定酶促反應速度，判斷柑橘黃酮對胰蛋白酶是否為可逆抑制。實驗重復3次，結果取平均值。

可逆抑制類型的判斷：保持“1.2.1.2”蛋白酶活性測定體系中的胰蛋白酶濃度不變(0.5 mg/mL)，固定柑橘黃酮濃度分別為0、0.33、0.66 mg/mL，改變底物BAPNA終濃度(0～0.64 mg/mL)，測定酶促反應速度，繪制雙倒數曲線，計算Vmax和Km值，判斷可逆抑制的類型。實驗重復3次，結果取平均值。

1.2.4 柑橘黃酮與胰蛋白酶結合機制的分析

1.2.4.1 柑橘黃酮對胰蛋白酶熒光的猝滅和機理分析

取胰蛋白酶(體系終濃度0.15 mg/mL)和不同濃度的柑橘黃酮(或柚皮苷)溶液混勻，分別于20 ℃(293 K)和35 ℃(308 K)孵育10 min，置于熒光分光光度計中進行發射光譜掃描，參數設置為激發光波長280 nm，發射光波長范圍300～420 nm，掃描速度200 nm/min，狹縫寬5 nm。每組實驗設置3個平行，結果取平均值。

熒光猝滅是由于熒光物質分子與其他小分子相互作用而引起的熒光強度降低的現象，猝滅機理包括動態猝滅和靜態猝滅，都可以用Stern-Volmer方程(公式(3))描述[16]，以柚皮苷濃度[Q]為橫坐標，加入柚皮苷前后胰蛋白酶熒光強度的比值F0/F為縱坐標作圖，根據公式(4)和(5)計算Stern-Volmer猝滅常數Ksv和表觀猝滅常數Kq，分析柑橘黃酮(柚皮苷)對胰蛋白酶的熒光猝滅機理[16]，式中τ0為生物分子的熒光壽命10-8s。

(3)

(4)

Kq=Ksv/τ0

(5)

1.2.4.2 結合常數和結合位點數分析

根據公式(6)，以lg[Q]為橫坐標，lg[(F0-F)/F]為縱坐標作圖，計算293 K(20 ℃)和308 K(35 ℃)下柑橘黃酮與胰蛋白酶的結合常數Ka和結合位點數n[16]。式中，F0和F分別為加入柚皮苷前后的熒光強度，[Q]為柚皮苷濃度。

(6)

1.2.4.3 熱力學參數和作用力分析

根據公式(7)-(9)計算20 ℃(293 K)和35 ℃(308 K)下柑橘黃酮與胰蛋白酶相互作用的熱力學參數：焓變ΔH、吉布斯自由能變ΔG和熵變ΔS，分析二者之間相互作用力的類型[17]。

(7)

ΔG=-RTlnKa

(8)

(9)

式中，R為氣體常數(8.314 J/(mol·K))，Ka1和Ka2分別為開爾文溫度T1和T2對應的結合常數。

2 結果與分析

2.1 最佳吸收波長的確定

波長掃描結果見圖1。產物、背景(底物+黃酮)在400 nm以下均有非常強的吸收，干擾大不能用于定量；400 nm以上時，隨著波長的增加，產物吸光值持續下降，但背景(底物+黃酮)吸光值下降更快，產物吸光值與背景吸光值之比持續上升并在420～440 nm之間處于較高水平；為降低背景干擾并兼顧產物測定靈敏度，選用420 nm作為產物測定的波長，該波長下背景吸光值較常用波長410 nm[5]減少了60.3%，產物吸光值與背景吸光值之比為410 nm時的1.75倍，極大地減少了反應體系的干擾。

圖1 最佳吸收波長的掃描 Fig.1 Scanning for optimum absorption wavelength

2.2 不同溫度下黃酮對胰蛋白酶抑制作用的影響

不同溫度下黃酮對胰蛋白酶抑制作用的影響見圖2。各溫度下，柑橘黃酮對胰蛋白酶活性的抑制作用均呈現濃度效應；同一黃酮濃度下，酶促反應溫度越低，抑制率越高，27 ℃時，0.66 mg/mL黃酮對0.5 mg/mL胰蛋白酶的抑制率最高達50.7%，高于37 ℃的29.9%和47 ℃的18.0%。

圖2 不同溫度下柑橘黃酮對胰蛋白酶的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of citrus flavonoids on trypsin at different temperatures

2.3 柑橘黃酮對胰蛋白酶抑制類型的研究結果

由圖3可知，隨著黃酮濃度的增加，直線斜率降低，而非向右平移，所以柑橘黃酮對胰蛋白酶的抑制作用是可逆的。可逆抑制類型的進一步分析結果見表1和圖4。隨著柑橘黃酮濃度的增加，Km值增加明顯，Vmax值有所降低，所以柑橘黃酮對胰蛋白酶的抑制屬于競爭性抑制和非競爭性抑制混合抑制類型，可能更接近競爭性抑制類型。

圖3 柑橘黃酮對胰蛋白酶的可逆性抑制作用Fig.3 Reversible inhibition of citrus flavonoids against trypsin

圖4 柑橘黃酮對胰蛋白酶的雙倒數曲線Fig.4 Lineweaver-Burk curve of trypsin in the presence of citrus flavonoids

表1 柑橘黃酮對胰蛋白酶抑制的Vmax和KmTable 1 Vmax and Km values of trypsin inhibited by citrus flavonoids

2.4 柑橘黃酮與胰蛋白酶的結合機制(熒光光譜法)

2.4.1 柑橘黃酮對胰蛋白酶熒光的猝滅作用

柑橘黃酮對胰蛋白酶熒光光譜的影響見圖5。隨著柑橘黃酮添加量的增加，胰蛋白酶的熒光強度不斷減弱，即發生了熒光猝滅；同時，最大吸收峰發生了微弱的紅移，由331 nm移至340 nm，說明柑橘黃酮與胰蛋白酶的色氨酸殘基發生了相互作用[18]。以柚皮苷(柑橘黃酮主要成分之一[19])代替柑橘黃酮提取物進行實驗，其對胰蛋白酶熒光光譜影響的規律與柑橘黃酮提取物一致，說明柑橘黃酮提取物對胰蛋白酶的熒光猝滅是柚皮苷等黃酮類化合物在起作用。

圖5 柑橘黃酮和柚皮苷對胰蛋白酶熒光光譜的影響Fig.5 Effect of citrus flavonoids and naringin on the fluorescence spectra of trypsin注：柑橘黃酮和柚皮苷的濃度單位均為mg/L。Note:The concentration unit of citrus flavone and naringin is mg/L.

2.4.2 熒光猝滅機理的分析和結合常數的計算

柑橘黃酮是混合物，由“2.4.1”可知，其與柚皮苷(柑橘黃酮主要成分之一)對胰蛋白酶的熒光猝滅規律高度一致。為了更清晰地揭示柑橘黃酮與胰蛋白酶的相互作用規律，故選用代表性成分柚皮苷(純度≥95%)進行后續分析。經繪制Stern-Volmer曲線[20]，計算得出柚皮苷對胰蛋白酶熒光猝滅的各種參數(見圖6和表2)。柚皮苷對胰蛋白酶的表觀猝滅常數Kq為5.38×1012L/(mol·s)(293 K)、4.4×1012L/(mol·s)(308 K)遠大于各種猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞常數2.0×1010L/(mol·s)[16]。此外，Ksv分別為5.38×104L/mol(293 K)和4.4×104L/mol(308 K)，猝滅常數隨著溫度的升高而降低，因此推斷柚皮苷對胰蛋白酶的猝滅不是由于分子擴散發生動態碰撞而引起的猝滅，而是二者結合引起的靜態猝滅[8]。

圖6 柚皮苷對胰蛋白酶熒光猝滅Stern-Volmer曲線Fig.6 Stern-Volmer curves of fluorescence quenching of trypsin by naringin

表2 柚皮苷對胰蛋白酶的熒光參數Table 2 Fluorescence parameters of trypsin in presence of naringin

以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作線性擬合，結果見圖7和表2。308 K下，柚皮苷與胰蛋白酶的結合常數Ka1為1.04×105L/mol，結合位點數n為1.10，293K下，Ka2為1.10×106L/mol，結合位點數n為1.34，即有一個結合位點。

圖7 lg(F0-F)/F與lg[Q]的關系圖Fig.7 Plot of lg(F0-F)/F vs lg[Q]

2.4.3 熱力學參數和作用力類型分析

柚皮苷與胰蛋白酶相互作用的熱力學參數和作用力類型分析結果見表3。根據文獻[17,21,22]，當ΔG<0、ΔS≥0、ΔH>0時，作用力主要為疏水作用力；當ΔG<0、ΔS<0、ΔH<0時，作用力主要為氫鍵和范德華力；當ΔG<0、ΔS>0、ΔH<0時，作用力主要為靜電作用。由表3可知，柚皮苷與胰蛋白酶作用的熱力學參數ΔG<0、ΔS<0、ΔH<0，推斷二者之間主要是氫鍵和范德華力在起作用。

表3 不同溫度下柚皮苷對胰蛋白酶作用的熱力學分析Table 3 Thermodynamic analysis of the effect of naringin on trypsin at different temperatures

3 討論與結論

本實驗結果表明，柑橘黃酮對胰蛋白酶活性具有抑制作用，且黃酮濃度越高，抑制效果越強；37 ℃時，0.66 mg/mL黃酮對0.5 mg/mL胰蛋白酶的抑制率為29.9%。柑橘黃酮對胰蛋白酶的抑制為可逆抑制，屬于競爭性抑制和非競爭性抑制混合抑制類型，而且競爭性抑制占主要地位。

熒光光譜常用來研究小分子與蛋白質的相互作用[16,17,23]。本實驗發現，柑橘黃酮(柚皮苷)能減弱胰蛋白酶的熒光光譜強度，熒光峰發生紅移，表現為靜態猝滅，且結合常數及結合位點數分析[16]發現柚皮苷與胰蛋白酶有1個結合位點，結合的主要作用力是氫鍵和范德華力。實驗中還發現，柚皮苷與胰蛋白酶的結合常數Ka隨溫度升高而降低，20 ℃(293 K)為1.10×106L/mol，35 ℃(308 K)為1.04×105L/mol，反映在低溫下兩者結合更強，這與不同溫度下柑橘黃酮對胰蛋白酶的抑制率吻合：在27 ℃下0.66 mg/mL柑橘黃酮對胰蛋白酶的抑制率為50.7%，高于37 ℃時的29.9%和47 ℃時的18.0%。

本研究揭示了柑橘黃酮對胰蛋白酶的抑制作用、抑制類型和結合機制，可為胰蛋白酶過量分泌相關疾病的特膳食品、保健食品開發作參考，以減緩疾病的發生和輔助治療。