宮內慢性缺氧對成年雄性大鼠心肌細胞eNOS表達及磷酸化的影響

王圣楠 李雅雅 陳幼芳 * 杜心清

（1 福建醫科大學附屬第二醫院心血管內科，福建 泉州 362000；2 廈門市兒童醫院超聲醫學科，福建 廈門 361000；3 泉州醫學高等專科學校臨床醫學院，福建 泉州 362000）

有前沿學者曾調研過流行病學特征，不健康子宮內環境對胎兒期的影響會導致兒童期易患疾病外，還會增加成人時期感染非傳染性疾病的風險[1]。如果胎兒持續暴露于不利的宮內環境，包括氧氣和營養因素，會使生理系統復位，導致心肌細胞數量和表觀遺傳的改變，從而導致成年后心血管疾病[2-3]。作為一氧化氮合酶的亞型之一，eNOS在引起心血管疾病的同時，若eNOS表達下降或生物活性下降，可引起血管內皮功能障礙[4]。磷酸化調控會干擾eNOS的活性在轉錄、翻譯階段，尤其是絲氨酸1177位點（Ser1177）和蘇氨酸495位點（Thr495）2個位點[5]。本研究在前人基礎上，通過研究eNOS分子活性修飾途徑即磷酸化的改變，以期探索面對宮內缺氧時eNOS活性改變的相應分子機制及成人疾病編程的研究。

1 材料與方法

1.1 缺氧模型建立與分組 由上海斯萊克實驗動物公司提供清潔級SD雌性孕鼠12只，孕齡7 d，通過隨機數字表隨機分為缺氧組與對照組（各n=6）。建立宮內慢性缺氧模型，6只孕鼠置于缺氧艙內，每日8 h持續缺氧，箱內氧濃度為（10.0±0.5）%。常氧對照組的6只孕鼠也置于相同的玻璃箱內，持續通入空氣[6]。

1.2 動物標本采集 按隨機數字表法在生產后于每窩剛生產后的大鼠里選取1只雄性，經過11個月的飼養，到實驗結束時，對照組有6只存活，缺氧組有5只存活。將動物麻醉之后迅速取出心臟，僅保留室間隔及左心室，固定于10%的甲醛溶液，脫水、包埋室溫備用，余標本液氮中速凍后轉存于-80 ℃冰箱備檢。

1.3 Western Blot法測定eNOS、eNOS（Thr495）、eNOS（ser1177）表達 配置試劑后組織切塊加入裂解液，待充分裂解后進行離心取上清，用考馬斯亮藍法測定各細胞樣本蛋白含量，進行蛋白樣品變性、電泳，封閉1 h后用一抗用封閉液稀釋（內參抗體稀釋度為1∶1 000），洗膜后將一抗反應膜放入二抗工作液中，用image J軟件分析灰度值（抗體及試劑盒分別由美國Zymed Laboratories公司、江蘇厚普生物公司提供）。

1.4 統計方法 使用SPSS22.0統計軟件對數據進行分析：計量資料用（）描述，行t檢驗。當P＜0.05時，表示存在統計學差別。

2 結果

Western Blot法測定eNOS、Ser1177、Thr495表達結果以Western Blot依次檢測eNOS、Thr495、Ser1177表達（圖1）。可見Thr495位點磷酸化程度有所升高而Ser1177位點磷酸化程度有所降低（圖2）。

圖1 Western Blot法檢測eNOS、Thr495、Ser1177表達

圖2 Western Blot法測定eNOS、Ser1177、Thr495表達結果

3 討 論

目前認為宮內慢性缺氧通常以變動eNOS及其分子伴侶，如CAV-1、HSP90、血清內皮素-1、CAM的表達，從而導致成人發生心血管疾病[7-8]。作為調控eNOS活性的重要途徑之一，宮內慢性缺氧過程中的eNOS磷酸化尚未見報道。

本研究發現，宮內慢性缺氧將導致雄性成年期出現eNOS蛋白表達下降，故提示宮內慢性缺氧對機體作用時間長，效果顯著，eNOS表達降低后會減少NO生成，心血管系統沒有NO的保護作用，會從胎兒期一直持續到中年，這可能是控制成人慢性宮內缺氧所致心血管疾病發生的機制[9-10]。

eNOS在翻譯后修飾階段有著復雜的模式，蛋白激酶與蛋白磷酸酶傳導的去磷酸化及磷酸化網絡充當對eNOS活性進行調節的重要翻譯后修飾[11-12]。磷酸化程度則直接影響eNOS與鈣調蛋白的結合力[13-14]。一方面蛋白激酶-B、蛋白激酶-A和鈣調蛋白都能在Ser1177位點磷酸化eNOS，從而增強eNOS與鈣調素的結合。另一方面，此外，蛋白激酶-A和蛋白激酶-C通道傳導THR495位點的eNOS磷酸化受到抑制，影響其和CaM結合在一起。細胞受刺激之后往往引發Thr495迅速去磷酸化，以推動CaM與eNOS結合生成NO。故eNOS活性與Ser1177和Thr495互相之間的磷酸化/去磷酸化程度相關。

綜上所述，慢性宮內缺氧可顯著下調成年雄性大鼠心肌細胞eNOS蛋白和eNOS Ser1177的表達，上調成年雄性大鼠心肌細胞eNOS Thr495的表達。