香菇多糖提取純化、生物活性及構效關系研究進展

陳 靜,李巧珍,宋春艷,章爐軍,尚曉冬,辜運富2

(1國家食用菌工程技術研究中心,農業部應用真菌資源與利用重點開放實驗室,上海市農業科學院食用菌研究所,上海 201403;2四川農業大學資源學院,成都 611130)

香菇Lentinula edodes(Berk.)Pegler俗稱香蕈、花菇,屬擔子菌門傘菌綱傘菌目光茸菌科。香菇因其鮮美口味和營養價值,成為最受歡迎的食用菌之一,主要種植于中國、日本及其他亞洲國家[1]。烘干后的香菇含58%—60%碳水化合物、20%—23%蛋白質、9%—10%纖維、4%—5%灰分和3%—4%脂肪[2]。國內外學者從香菇菌絲體和子實體中分離出多種活性成分,包括多糖[3-4],蛋白質[5-6],嘌呤[7-8]等。其中,香菇多糖因其豐富的營養和藥用價值受到了廣泛的關注和研究[9]。香菇多糖以β-(1→3)葡萄糖殘基為主鏈,β-(1→6)葡萄糖殘基為側鏈,單糖組成主要包括葡萄糖、甘露糖和半乳糖[10,3]。研究表明,香菇多糖具有免疫調節[11-12]、抗氧化[13-14]、抗腫瘤[15-16]、抗病毒[17,3]等活性。本研究通過對香菇多糖提取純化、生物活性及構效關系幾個方面的研究進行綜述,以期為香菇多糖的后續研究與開發利用提供理論依據。

1 香菇多糖的提取純化

香菇多糖一般采取傳統方法,以水為溶劑,加熱提取。多糖提取率受料液比、時間、次數和溫度等因素的影響。馮賢達等[18]研究表明,多糖提取最佳工藝為料液比1∶30,提取溫度90℃,兩級錯流提取。第1級提取60 min,第2級30 min。李博等[19]研究表明,香菇多糖熱水浸提最佳工藝為:浸提時間90 min,溫度80℃,料液比1∶45,醇析乙醇量1∶3,此條件下多糖得率為24.88%。萬閱等[20]研究表明,與傳統熱水浸提法比較,超聲波提取法多糖得率更高,且耗時少。Zhao等[4]采用超聲輔助多糖提取,最佳提取條件為:溫度45℃,時間21 min,超聲功率290 W,多糖得率可達9.75%,是熱水萃取的1.62倍。聶小寶等[21]發現,與傳統提取方法相比,微波輔助提取具有時間短、多糖純度高、節能、操作簡單、安全、提取率高等優點。程俊文等[22]結果表明,纖維素酶﹑果膠酶﹑木瓜蛋白酶的最佳提取工藝參數依次為加酶量0.8%,溫度45℃,pH 4.5,提取時間1 h;加酶量1.0%,溫度45℃,pH 3.5,提取時間2.0 h;加酶1.0%,溫度45℃,pH 4.0,提取時間1.5 h。Ke等[23]研究表明,勻漿法能夠有效地提高香菇多糖的提取效率。Li等[14]用真空技術破壁提取香菇多糖,并采用響應面法優化提取工藝參數。結果表明,多糖提取的最佳條件是62℃,真空0.08 MPa,1 200 r∕min攪拌25 min,料液比1∶26(V∕W)。在此條件下,多糖的得率為4.28%。Zhang等[24]采用超聲強化亞臨界水兩步法從香菇中提取多糖,最佳工藝條件:萃取溫度140℃,提取時間40 min,料液比1∶25(V∕W),超聲波功率190 W,該條件下多糖的提取率為17.34%。

香菇多糖基本提取溶劑有三種:酸溶液、堿溶液和水。提取的粗多糖可通過一系列技術進一步純化,如用乙醇、乙酸、CTMAB等沉淀,過氧化氫脫色,Sevag法去除蛋白質,離子交換色譜法、凝膠過濾法和親和色譜法層析[25]。通常,離子交換色譜法用來分離中性多糖和酸性多糖[26]。香菇多糖的幾種提取方法和純化工藝見表1。

表1 香菇多糖不同提取方法和純化工藝Table 1 Identification of lentinan by different extraction method and purification procedure

2 香菇多糖的生物活性

2.1 免疫調節活性

食用菌多糖能增強人體免疫力,幫助宿主適應不同的環境脅迫且無副作用,被稱為生物反應調節劑(Biological response modifiers,BRMs)[25,34]。香菇多糖可刺激宿主產生不同的效應細胞并發揮作用,如T細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞,也可增加免疫細胞的吞噬能力來殺滅人體中的癌細胞,且對遷移的癌細胞也有作用。它被稱為體內T細胞定向免疫增強劑、巨噬細胞抗腫瘤活性的刺激劑[35-37]。Kupfahl等[11]檢測了香菇多糖在小鼠李斯特菌感染模型中的免疫應答作用,發現香菇多糖可通過增強CD8 T細胞的特異性來提高小鼠抗李斯特菌的作用。同時,香菇多糖能促進B淋巴細胞增殖,誘導B淋巴細胞分化并合成抗體[38-40]。另外,Wang等[41]結果表明,無論體外還是體內,香菇多糖可以通過增強體腔細胞的生存能力和吞噬作用提高日本海參的非特異性免疫力。

2.2 抗腫瘤活性

1969年,Chihara從香菇中分離出香菇多糖,發現其可使測試小鼠腫瘤縮小80%或完全消退[42-43]。香菇多糖抗腫瘤作用的重要機制為在腫瘤部位觸發延遲型超敏反應,并誘導免疫細胞的產生,如自然殺傷細胞和T細胞[44]。且香菇多糖能增強某些特定免疫細胞的吞噬能力,以搜索和破壞人體遷移癌細胞[45-46]。另外,香菇多糖能在體外抑制小鼠肉瘤細胞的增殖,其抑制率與分子量有關[32]。Zhang等[27]研究發現,香菇多糖可通過線粒體途徑誘導腫瘤細胞凋亡,且對荷瘤小鼠體重和器官沒有不良影響。Zhang等[47]研究表明,香菇多糖誘導腫瘤細胞凋亡是通過快速刺激活性氧的產生,使線粒體膜電位喪失以及細胞內Ca2+濃度增加形成的。

2.3 抗氧化活性

抗氧化活性是天然多糖的一種常見生物活性,受原料、提取工藝和干燥方法影響[48-50]。Wang等[13]研究表明,香菇菌絲體多糖具有抗氧化活性,可降低衰老風險。不同提取方法獲得的多糖不僅具有不同的化學成分和構象,而且抗氧化活性也不同。Chen等[51]用熱水從香菇子實體中提取粗多糖LEP(Lentinus edodespolysaccharide),經DEAE-瓊脂糖凝膠CL-6B層析純化得到三種多糖組分,其中,LEPC1具有明顯的濃度依賴性抗氧化活性。Zhang等[24]采用超聲強化亞臨界水萃取法(Ultrasonic enhanced subcritical water extraction,USWE)從香菇中提取多糖,通過DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)自由基清除法評價其抗氧化活性,并與亞臨界水萃取(Subcritical water extraction,SWE)、超聲波萃取(Ultrasonic extraction,UE)、熱水萃取(Hot water extraction,HWE)多糖樣品進行比較,發現USWE樣品的抗氧化活性最高。與傳統熱水萃取法相比,動態超高壓微射流技術(Dynamic high pressure microfluidization,DHPM)輔助萃取香菇多糖對羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基和亞硝酸鹽的清除能力更強。香菇多糖的抗氧化能力還與其分子量有關,低分子量組分具有較高的抗氧化能力,而高分子量組分具有較強的抗腫瘤活性[33,52-53]。

2.4 抗病毒活性

一般來說,抗病毒化合物抑制甚至殺死病毒主要通過三種方式:第一,直接接觸并殺死病毒;第二,防止病毒吸附滲透到宿主細胞;第三,阻礙病毒復制和生物合成或抑制病毒組裝、成熟和釋放[54]。香菇多糖在體外對傳染性造血器官壞死病病毒表現出一定程度的直接滅活作用[55],其機制可能與穩定的病毒-多糖復合物占據病毒包膜上的位點有關[56-59]。香菇多糖具有抗人體免疫缺陷病毒和單純皰疹1型病毒作用[60-61],且具有較強的體外抗乙型肝炎病毒活性[4]。香菇多糖能抑制1型脊髓灰質炎病毒和1型牛皰疹病毒的復制[17]。此外,香菇多糖可以選擇性地與細胞表面受體結合,進一步抑制病毒在細胞中的侵襲[55,62]。Ren等[3]從香菇菌絲體中提取了一種具有抗病毒活性的多糖,其通過調節機體的先天免疫和特異性免疫來實現直接滅活病毒和抑制病毒復制。

3 香菇多糖的構效關系

香菇多糖的初級結構以(1→3)-β-D-葡萄糖殘基為主鏈,每5個葡萄糖有2個(1→6)葡萄糖殘基支鏈,支鏈由(1→6)-β-D-和(1→3)-β-D-葡萄糖殘基組成,也含有少數內部β-(1→6)鍵[63]。Maeda等[64]利用光散射測定的香菇多糖的平均分子量為950—1 050 ku,Suzuki等[65]通過凝膠滲透色譜和準彈性光散射測定的香菇多糖的分子量為300—800 ku[65]。Zhang等[66]采用超聲輻照法獲得了304—1 832 ku不同分子量的香菇多糖。

3.1 結構與生物活性的關系

多糖由一定數量的單糖殘基組成。多糖的一級結構是通過單糖殘基位置、糖鏈的位置以及單糖殘基的序列來確定的[38]。對食用菌來說,主鏈由β-(1→3)連接且有β-(1→6)分支的葡聚糖結構,具有抗腫瘤活性,主鏈由(1→6)連接的β葡聚糖活性較低,高分子量葡聚糖比低分子量葡聚糖活性高[67-69]。當香菇多糖經二甲基亞砜、尿素或氫氧化鈉處理后,其三級結構被破壞,隨著變性程度的加深,抗腫瘤活性降低[70]。另外,研究發現,主鏈的分支度也是影響其活性的因素。一般來說,活性最強的聚合物的分支度在20%—33%[38]。Bae等[71]研究發現,多糖去分支可以提高其生物活性,當香菇多糖的分支度為32%時,免疫調節和抗腫瘤活性最大。

藥用食用菌免疫刺激活性不僅來源于生物活性多糖,還可通過多糖-蛋白復合物產生。螺旋葡聚糖可附著在某些蛋白上形成復合物,進而刺激巨噬細胞產生抗體[72]。研究表明,當β葡聚糖與蛋白質以復合物形態存在時,其生物效率得到提升[73]。香菇多糖-蛋白質復合物在體內比未結合蛋白的多糖具有更高的抗腫瘤活性,且進一步分離蛋白后的香菇多糖無抗腫瘤活性[74-76]。這表明多糖結構的復雜程度與其免疫調節和抗腫瘤活性的強弱有關。

3.2 分子量與生物活性的關系

多糖是天然高分子多聚物,分子量的高低是影響其生物活性的重要因素。分子量過低,多糖不能形成具有活性的聚合結構,而過高則不利于多糖進入生物體內[77]。眾所周知,香菇多糖的分子量與免疫增強活性密切相關[28,78]。相對分子質量高的香菇多糖比相對分子質量低的具有更強的抗病毒活性[4]。這可能與其和免疫細胞碳水化合物受體的親和力不同有關[79]。分子量為400—600 ku的香菇多糖具有多種生物活性,如抗腫瘤(纖維肉瘤)、抗病毒(新城疫病毒)、刺激細胞因子表達等[26,1]。Ren等[3]研究發現,合適分子量的多糖能夠保證自身輕易通過組織屏障進入細胞,極大地提高了其抑制病毒復制的生物學效率。Qian等[33]研究發現,分子量最高的香菇多糖的抗腫瘤活性較差,可能是因為香菇多糖的體積太大,無法進入細胞所致。而分子量較高的香菇多糖對體外培養的人原位胰腺腺癌細胞和人宮頸癌細胞均有較高的抑制作用。Wang等[29]研究也發現,高分子量多糖的抗腫瘤作用強于低分子量多糖。高分子量多糖在各濃度水平上具有較高的腫瘤抑制率,而且表現良好。

4 總結與展望

香菇多糖是一類結構多樣的大分子聚合物,其單糖組分通過糖苷鍵相互連接,不同的連接位點,會形成多種多樣的分支結構或線性結構。隨著香菇全基因組測序的完成,學者們已經開始從分子水平上揭示香菇多糖代謝調控機制,但其多糖合成的代謝途徑還難以解析。目前,香菇多糖主要靠從香菇子實體或菌絲體中分離純化,提取分離步驟復雜、得率低、質量難以控制,無法滿足工業化生產的需要。為提高香菇多糖得率,不僅可以采用新型技術輔助提取香菇多糖,而且可以通過遺傳育種手段提高香菇菌種多糖含量,包括紫外誘變[80-81]、氮離子誘變[82]、紫外誘變結合雜交育種[83]等。如何將新技術與遺傳育種研究成果更好地應用于實際生產中,需要結合實際情況做更多的研究和轉化工作。

香菇多糖具有多種藥效,包括免疫刺激[12]、抗腫瘤[16]、抗感染[84]和抗炎[85]等。但是,要提高其水溶性、口服后滲透腸道黏膜的能力及臨床療效,還需要與化學修飾、納米生物技術、靶向治療和免疫治療等新興技術相結合,開展相關的臨床試驗。另外,雖然香菇多糖具有多種生理活性,但是其結構復雜,均一多糖獲取困難,而且不同材料不同提取方法獲得的多糖在結構和活性上存在差異,缺乏對其構效關系的完整認識。而要闡明多糖的構效關系,則要通過生物、化學、計算機等手段,將各種儀器方法確定的基本結構參數和活性參數集合起來。