低能量脈沖電磁場對金黃色葡萄球菌生長的影響及其與抗生素的協同抑菌作用

李旭綱，陳一心,2，邱旭升,2

1.南京中醫藥大學中西醫結合鼓樓臨床醫學院，江蘇南京210008；2.南京鼓樓醫院骨科，江蘇南京210008

前言

感染性骨不連一直是骨科臨床治療的棘手問題，其治療目標是消除感染、促進骨折愈合，手術治療是目前唯一有效的治療方法。雖然近年來由于優良的內固定材料及手術方法的改進，感染性骨不連的治療效果有了很大的改善，但其花費高且術后仍存在感染復發、骨折不愈合的風險［1］。因此，尋找一種無創、經濟且有效的治療方法十分必要。脈沖電磁場（Pulsed Electromagnetic Field, PEMF）用于骨不連的治療已有40多年，其可以控制破骨細胞的形成，刺激人骨髓基質細胞,促進成骨細胞的增殖,從而加快骨不連愈合［2-4］。如果PEMF 同時具有抑菌或殺菌作用，那便為感染性骨不連的治療提供新的思路。近年來，應用各種物理磁學抑菌的報道不少，其中包括極低頻電磁場、旋轉磁場、靜磁場等等［5-7］。Del Re等［6］研究發現極低頻電磁場的暴露使得大腸桿菌內熱休克蛋白增多，從而促使細菌凋亡；Fojt 等［8］認為電磁場可能對細胞膜中離子通道滲透性產生影響，從而影響離子進入細胞的運輸，從而導致生物體內的生物變化，另一個可能的影響是由于磁場暴露而形成自由基［9］。而對于低能低強度PEMF 對細菌的作用，尚沒有相關報道。因此，本研究選用骨科感染常見致病菌金黃色葡萄球作為研究對象，研究PEMF對金黃色葡萄球菌生長的影響及其與抗生素之間的協同作用。

1 實驗材料

1.1 菌種

金黃色葡萄球菌（ATCC 29213），來自南京鼓樓醫院檢驗科。

1.2 培養基

營養肉湯培養基（南京便診生物科技有限公司）；哥倫比亞血瓊脂培養基（江門市凱林貿易有限公司）。

1.3 儀器與設備

骨生長刺激儀（荷蘭IMD.B.V 公司，Orthopulse?Bone Growth Stimulator，能產生場強1 Gs、頻率15 Hz、脈寬5 μs、脈沖群寬5 ms、脈沖群不應期62 ms的PEMF）；DENSICHECK比濁儀（法國生物梅埃利公司）；DRP-9082型電熱恒溫培養箱（上海森信實驗儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 菌液制配

采用接種環選取單個直徑約2 mm的標準金黃色葡萄球菌菌株菌落，使用平板劃線接種法接種至新的哥倫比亞血瓊脂培養基，置入37 ℃溫箱培養24 h。隔天取出血瓊脂培養基再次選取單個直徑約2 mm菌落比濁至0.5麥氏度（相當于1.0×108個細菌/mL）備用。

2.2 不同作用時長的PEMF 對金黃色葡萄球菌生長的影響

取無菌12 孔細胞培養板，每孔加入2 mL 營養肉湯培養基；將備用菌液稀釋104倍后加入培養板，每孔加入500 μL。PEMF 組培養皿置于骨生長刺激儀線圈式換能器中央，開啟設備，使之充分暴露于PEMF；對照組培養皿置于骨生長刺激儀線圈式換能器中央，關閉設備。所有培養板均置于37 ℃恒溫箱培養，每間隔2 h 取培養液倍比稀釋后接種至哥倫比亞血瓊脂培養基，37 ℃溫箱培養24 h 后計菌落數（Colony Forming Unit, CFU）。分別對2、4、6、8 h 這4 個時間點的細菌數進行計數，每個時間點各組均重復6次。

2.3 PEMF與抗生素對金黃色葡萄球菌的聯合影響

實驗分4 組，即對照組、PEMF 組、抗生素組、PEMF+抗生素組。將備用菌液稀釋至105CFU/mL，頭孢呋辛配至0.687 5 μg/mL，取無菌12 孔細胞培養板。對照組與PEMF 組加50 μL 105CFU/mL 菌液、450 μL 生理鹽水以及2 mL 營養肉湯培養基；抗生素組和PEMF+抗生素組加50 μL 105CFU/mL 菌液、450 μL 0.687 5 μg/mL 抗生素以及2 mL 營養肉湯培養基；PEMF 組及PEMF+抗生素組培養皿置于骨生長刺激儀線圈式換能器中央，開啟設備，使之充分暴露于PEMF；對照組、抗生素組培養皿置于骨生長刺激儀線圈式換能器中央，關閉設備。所有培養板均置于37 ℃恒溫箱培養，8 h后取培養液倍比稀釋后接種至哥倫比亞血瓊脂培養基，37 ℃溫箱培養24 h 后計菌落數。每組重復6次。

2.4 統計學分析

采用SPSS 22.0統計學軟件對上述計數結果進行分析，先進行方差齊性判斷，符合正態分布的測量數據以均數±標準差表示,采用成組樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 不同作用時長的PEMF 對金黃色葡萄球菌生長的影響

2 h與4 h PEMF組與對照組之間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。6 h與8 h的PEMF干預則顯著抑制了金黃色葡萄球菌的生長，差異有統計學意義（P<0.05），6 h時PEMF組菌落計數約為對照組的23%（P<0.001）；8 h時PEMF組菌落計數約為對照組的28%（P=0.001）。詳見表1、圖1。

表1 不同PEMF干預時長下金黃色葡萄球菌的細菌數（±s）Tab.1 Bacterial count of Staphylococcus aureus under different intervention durations of PEMF(Mean±SD)

表1 不同PEMF干預時長下金黃色葡萄球菌的細菌數（±s）Tab.1 Bacterial count of Staphylococcus aureus under different intervention durations of PEMF(Mean±SD)

細菌數=菌落數×倍比稀釋數

作用時長/h 對照組PEMF組t值P值2 4 6 8 341±33 2 718±661 49 567±5 462 298 333±61 389 315±11 2 567±448 11 650±4 103 83 000±223 334 1.657 0.490 13.192 6.924 0.158 0.644<0.001 0.001

圖1 PEMF不同干預時長哥倫比亞血瓊脂板培養圖片Fig.1 Columbia blood agar plate culture under different intervention durations of PEMF

3.2 PEMF與抗生素對金黃色葡萄球菌的聯合影響

經倍比稀釋（104倍），對照組、PEMF組、抗生素組和PEMF+抗生素組菌落計數結果分別為（65.2±11.4）、（21.8±7.9）、（22.8±2.9）、（6.0±2.9）CFU/mL。PEMF組、抗生素組、PEMF+抗生素組菌落計數分別是對照組的32%、34%，10%，都顯著少于對照組（P<0.05）；同時PEMF+抗生素組菌落計數顯著少于單獨的PEMF組和抗生素組（P<0.05）（圖2）。

圖2 PEMF與抗生素對金黃色葡萄球菌的聯合影響（體外干預8 h）Fig.2 Synergistic antibacterial effect of PEMF and antibiotics on Staphylococcus aureus(in vitro intervention for 8 hours)

4 討論

感染性骨不連涉及感染和骨不連，多由嚴重開放性骨折所致，感染是骨不連的主要原因。消除感染，促進骨折愈合是感染性骨不連治療的目標，手術治療是目前治療感染性骨不連的唯一手段，但其費用昂貴，且常需二次手術治療［1］。作為一種被美國FDA批準應用于臨床的治療技術，PEMF擁有無創、溫和、經濟等優點，是一種很有希望的骨感染輔助治療方法。

4.1 低能量PEMF的臨床應用

能用于臨床治療的PEMF往往是低能低強度的。早在1981年Heckman 等［2］發現PEMF 可有效促進骨折愈合；Garland 等［10］通過對139 名骨不連患者的長期隨訪發現，經過每天至少3 h的PEMF治療，患者骨不連愈合率約為80%。林通等［11］發現PEMF 聯合雙膦酸鹽及鈣劑治療老年骨質疏松癥在止痛及增加骨密度值方面有更好的療效。有研究表明PEMF 可通過對一氧化氮信號傳導的PEMF 效應來控制傷口中內源性IL-1β 的動力學，從而通過調節機體的抗炎途徑來減少術后的疼痛和麻醉藥的使用［12-14］；潘云虎等［15］通過對糖尿病大鼠急性下肢缺血模型的實驗研究發現PEMF 可通過刺激血管內皮細胞釋放FGF-2促進糖尿病大鼠急性下肢缺血的血管新生。Kwan等［16］的一項臨床隨機對照研究發現PEMF 可能改善微循環，從而促進慢性糖尿病足潰瘍的傷口愈合。低能量PEMF 在治療骨質疏松、促進骨折愈合、減少術后疼痛以及改善微循壞方面均有一定的積極作用。此外，亦有不少動物實驗結果表明PEMF有促進神經損傷修復的功能，但缺少相應的臨床研究報導支持［17-18］。

4.2 高能量PEMF的殺菌應用

目前關于PEMF 對細菌作用的研究主要集中在污水處理、食品消毒領域，其所采用的PEMF 為高能高強度電磁場，并不能應用于人體。如Piyadasa等［19］研究發現商用水處理器所產生的PEMF 可導致細菌活力和培養能力下降；李梅等［20］發現長時間高強度的PEMF 暴露使細胞表面發生了不可修復的破損現象，造成細菌正常功能的喪失；張咪［21］發現高強度脈沖磁場可有效殺滅食品中的李斯特菌，并認為高強度PEMF 的暴露加快了鈣離子的跨膜運動,胞內鈣離子濃度的升高導致了李斯特菌的死亡。

4.3 低能量PEMF的殺菌作用

與已有報導的高能量PEMF殺菌報導不同，本研究采用可供臨床應用的低能量PEMF，發現低能量的PEMF 也同樣具有殺菌作用。研究結果表明2 h和4 h 的PEMF 干預組計數結果無統計學差異，該時期的細菌處于遲緩期，是細菌對新環境的適應過程，代謝活躍但分裂緩慢；而6 h與8 h的PEMF干預則顯著抑制了金黃色葡萄球菌的生長，此時期的細菌處于對數生長期，該時期細菌大小、形態、染色、生物活性都很典型，對外界環境因素的作用敏感［22］。現有研究表明不同電磁場的脈沖個數、持續時間、頻率都是可變的，這些因素可能導致微生物失活的不可逆電穿孔機制，如電解和釋放幾種自由基，從而導致單獨或與電場聯合殺滅微生物［23］。同樣，細菌膜電位也會隨著PEMF的干預而發生改變，使細菌的代謝狀態發生根本性的生物學變化［24］，這一變化可能促使細菌膜的損傷，影響細菌增殖［25］。此外，本研究還表明PEMF 與抗生素具有協同抗菌作用。Pilla 等［26］研究發現在PEMF作用下，細胞內Ca2+釋放，導致Ca2+與鈣調蛋白的結合增加以及與新陳代謝、炎癥、細胞凋亡等相關的下游信號通路增多。可見，與藥物療法不同，PEMF 干預很可能通過幾個生物級聯而不是一個狹窄的信號通路發揮作用。我們也因此猜想PEMF 與抗生素之間不僅僅是單方面抑菌作用的疊加，二者之間可能也存在相互的作用。另一方面，有文獻報道PEMF的干預可誘導機體產生一氧化氮，一氧化氮是為數不多的已知的氣體信號分子之一，具有擴張血管、減輕炎癥的作用［27］。由于感染的骨組織血供受到破壞，因此骨組織中抗生素的濃度往往達不到最低殺菌濃度，因此單純使用抗生素治療骨感染效果往往不理想［28］，一氧化氮的擴血管作用可改善局部的微循環，從而提高局部抗生素濃度。所以我們猜想在體內，PEMF 與抗生素的協同抑菌作可能優于體外。

本研究也存在一定的局限性。PEMF 療法影響生物學的生物物理和細胞機制是復雜的，仍需進一步深入研究。此外，本研究僅選取了骨感染中最常見的金黃色葡萄球菌，PEMF 對于骨感染中其它相關細菌是否同樣存在抑制作用，值得進一步研究。

5 結論

本研究發現低能量PEMF 可以顯著抑制對數生長期金黃色葡萄球菌，同時與抗生素之間具有協同抑菌作用，另一方面，PEMF 對促進骨折愈合、減少術后疼痛以及改善微循壞均有一定的積極作用，可應用于臨床。因此，PEMF 是一種很有希望的骨感染輔助治療方法。