CD4 單陽參考品輔助檢測九色標記人血樣品的流式分析技術

徐曉雪

（首都醫科大學中心實驗室，北京 100069）

流式細胞術是利用流體聚焦原理，高速檢測流體中單個細胞或微顆粒多種熒光標記參數的技術，具有高速、定量、單細胞多參數的特點，常用來分析血液細胞、培養細胞等復雜細胞群體中多種細胞標志物的表達差異，可以幫助醫學工作者了解細胞的分化、增殖和功能狀態[1]。隨著流式細胞儀的發展和標記熒光的豐富，流式檢測可以同時檢測的指標不斷增多，流式多參數檢測使檢測數據的信息量成倍增加，不同檢測指標可以互相印證，數據可靠度大幅提升。同時還可以節省實驗樣品和試劑，減少樣品制備步驟、大大提高流式實驗的效率，成為流式技術的重要發展方向，應用范圍不斷擴大。目前，已經出現了超過20～30 色的流式分析方案，多參數流式技術是醫學科研與臨床中重要的單細胞分析技術之一[2]。但是，多參數流式技術檢測影響因素復雜，各項檢測參數調節范圍大，操作主觀性強，常規簡單分析的手動調節方式無法滿足檢測要求，需要更加客觀科學的設定檢測參數才能獲得理想的結果。基于此，本文以FACSymphony 流式細胞儀檢測九色標記人外周血實驗為例，詳細介紹在多參數流式儀上客觀分析多色樣品的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料 多種熒光標記CD4 抗體參考品試劑盒，BV480 標記CD3 抗體，BUV395 標記CD4 抗體，PERCPCY5.5 標記CD8 抗體，PECY7 標記CD25抗體，BV711 標記CD27 抗體，BB515 標記CD45RA抗 體，APC-R700標記CD56抗體，AF647標記CD127 抗體，BV786CD197 抗體，溶血素，染色緩沖液，洗滌緩沖液，流式染色緩沖液，CST 質控微球（以上試劑購自美國BD 公司）。材料：人靜脈血5 ml，采自健康志愿者。

1.2 主要儀器 BD FACSymphony 流式細胞儀（美國BD 公司），臺式冷凍離心機Allegra X-15R（美國貝克曼公司）。

1.3 樣品制備

1.3.1 人外周血全血細胞表面抗體標記九色樣品制備取200μl 全血，加入推薦用量的BV480 標記CD3抗體，BUV395標記CD4抗體，PERCPCY5.5標記CD8 抗體，PECY7 標記CD25 抗體，BV711 標記CD27抗體，BB515 標記CD45RA 抗體，APC-R700 標記CD56 抗體，AF647 標記CD127 抗體，BV786CD197抗體和染色緩沖液，室溫避光孵育30 min，加入5 ml溶血素，室溫溶血10 min，離心洗滌300 g，5 min，2次，加入洗滌緩沖液重懸至500 μl。

1.3.2 九色單陽樣品與空白對照制備 每個單陽樣品管加入200 μl 全血，分別加入推薦用量的BV480標記CD3 抗體，BUV395 標記CD4 抗體，PERCPCY5.5 標記CD8 抗體，PECY7 標記CD25 抗體，BV711 標記CD27 抗體，BB515 標記CD45RA 抗體，APC-R700 標記CD56 抗體，AF647 標記CD127 抗體，BV786CD197 抗體和染色緩沖液，室溫避光孵育，溶血素，離心洗滌同上，加入洗滌緩沖液重懸至500 μl。另取200 μl 全血樣品，不加入熒光抗體，僅溶血素，離心洗滌同上，加入洗滌緩沖液重懸至500 μl，作為空白樣品。

1.3.3 人外周血全血細胞九色CD4 單標樣品制備每個單陽樣品管加入200 μl 全血，分別加入與檢測樣品相同熒光素標記的參考品試劑盒中的CD4 抗體，即BV480 標記CD4 抗體，BUV395 標記CD4 抗體，PERCPCY5.5 標記CD4 抗體，PECY7 標記CD4抗體，BV711 標記CD4 抗體，BB515 標記CD4 抗體，APC-R700 標記CD4 抗體，AF647 標記CD4 抗體，BV786CD4 抗體和染色緩沖液，均采用推薦用量，室溫避光孵育，溶血素，離心洗滌同上，加入洗滌緩沖液重懸至500 μl。

1.4 儀器校準 儀器保持維護良好狀態下運行CST質控追蹤程序，校準儀器基本參數穩定。

1.5 儀器最佳檢測器電壓確定 逐個分析各色標記CD4 單陽樣品，目標檢測器參數從300 開始，每次遞增30，直到600 或者檢測信號接近檢測器上限停止，讀取各樣品陰性、陽性群體熒光中位數值，計算各檢測通道的信噪比，以信噪比最高的檢測器電壓值做為本通道最佳檢測電壓。

1.6 根據染色樣品確定最佳實驗檢測電壓 在初步檢測參數下運行9 色樣品，檢查各通道信號強弱是否適合，對于熒光強度超出檢測范圍的通道要下調檢測電壓保證信號位于檢測器的線性采集窗口內，調整后確定為最佳檢測參數，完成九色樣品采樣。

1.7 CD4 單陽計算補償參數 建立儀器自動補償程序，分別獲取陰性對照樣品和九個CD4 單標樣品，準確選取淋巴細胞群和各CD4 單陽群，運行補償計算程序，計算并保存補償參數。

1.8 九色單陽對照驗證補償參數 將補償參數賦值給之前獲取的9 色樣品數據，在新補償參數下采集9例檢測抗體標記單陽樣品，驗證補償條件無誤，確定補償參數。

2 結果

檢測顯示，補償前群體模糊不清，無法確定檢測數據質量，使用確定好的補償參數對9 色樣品數據進行熒光補償，補償后見圖1，其中藍色門圈選CD4+CD45RA-輔助T 淋巴細胞的效應群體，對比補償前后圖可見細胞群體的位移。此方法獲取的9色標記數據，各通道熒光溢漏擴散均較理想，陰性、陽性群體區分明顯，各細胞群體指標顯示清晰，可完成無重復采集的多色樣品分析。

圖1 CD4 單陽參考品輔助檢測九色標記人血樣品

圖1 （續）

3 討論

多參數流式檢測具有參數多、速度快、影響因素多、分析難度大、數據質量要求高等特點[3]，在流式實驗中是檢測難度最高的一類。通常在多色流式檢測時，需要實驗人員在采樣的短暫過程中，憑借經驗對多個參數完成人為設置。本實驗中，可以看到在檢測過程中，即使是在最優的檢測參數下，操作者也只能觀察到未經補償的雜亂群體，既無法判斷分群情況，更無法估計熒光溢漏擴散的情況。因此，通常是手動調節參數后采集少量樣品，運行補償程序，采集單陽對照，計算補償后代入預試，根據補償后群體分布情況調整電壓，往往需要反復調整多次，才能使數據較為理想，但是既浪費樣品，又耗費時間，并且由于主觀分析的隨意性和調整時間的局限，往往不能達到最佳的檢測參數。對于流式多色檢測，指標眾多，群體數量巨大，檢測中要求盡可能清楚區分所有的群體，就必須注重溢漏擴散的干擾。溢漏擴散主要來自于檢測器的干擾信號，只有使用信噪比盡可能高的檢測參數才能得到更小的溢漏擴散，才能最大限度的將陽性和弱陽性群體從背景中分離出來[4，5]。本方法利用了流式儀器通道的性能特點，利用BD 公司的CD4 抗體參考品試劑盒，預先利用光譜匹配，陽性明確的單色樣品，分析確定各不同檢測參數下檢測通道的性能表現，選取各通道的最佳檢測參數，在實際檢測中以最優參數為參考，僅需要對少數超出界限的通道進行微調，降低檢測參數至檢測器線性范圍上限即可，大大地減少了多色分析中實驗人員的主觀分析步驟，不需要反復多次上樣，節約樣品，可有效提高數據質量。

本研究采用的參考樣品為人血細胞抗CD4 單陽性標記樣品，在人免疫細胞表面分布的蛋白標志物中，CD4 分子數量中等，是良好的陽性參考，可以代表一般的檢測指標狀態，并且是實驗室常用抗體，容易獲得。本次使用的組合參考品試劑盒中CD4 抗體為同一克隆，且抗體均經過滴定，反應條件一致，由CD4 單陽標品檢測得到的檢測通道信噪比最佳檢測電壓是檢測器的物理參數[6]，每臺儀器都有固定的數值，理論上適合所有指標的檢測，可以作為多色分析的初設參數，但一些極高表達指標有可能產生超出檢測器線性范圍的熒光信號，這時信號無法準確補償，因此檢測中需要確保檢測信號線性度，只需要在上樣過程中根據樣品信號的實際情況，快速將超限通道的電壓降低，使信號進入檢測器線性范圍，微調之后的檢測電壓即是適合本實驗指標的最佳檢測參數。對于低表達指標一般不需要調高檢測器電壓，因為反而會使信噪比下降，降低通道的分辨力[7]。在上述樣中僅需對少數超限通道調低電壓即可，不需要反復上樣，節省了樣品細胞和時間。

使用優化后的參數完成采樣后樣品數據仍無法直接分析，由于流式儀器通道之間的熒光滲漏，各通道的信號互相混雜無法準確辨認，需要準確的計算補償[8，9]。熒光補償是對不同通道之間熒光滲漏的調整操作，目的是盡可能將通道中的漏光排除，保證各通道信號的特異性，在多色分析中對于一個數據給予不同的補償參數可能會得到完全不同的分析結果，因此補償數據也很關鍵[9]。一般流式檢測常用單陽樣品，確定各通道的漏光與檢測信號熒光的比例進行補償，但是在多參數流式實驗中通常會包括一些表達量低或者陽性比例低的指標，如CD127、CD25、CD197，這些指標的檢測通道和漏光通道上的信號較弱，不容易獲得滿意的補償數據，因此往往使用較強的單陽樣品代替（如補償微球）。本研究使用相同熒光素標記的CD4 單陽代替，雖然抗體標記蛋白不同，但是熒光素相同（同一廠家），光譜穩定，可以替代使用。同時，由于各色的CD4 標記細胞為相同群體，補償時的細胞熒光本底更為一致，結果與使用補償微球計算的結果近似，且檢測信號分布在線性范圍之內，避免了微球補償時陽性群體信號超出檢測器線性范圍的情況[10，11]。為了使計算的補償參數更加匹配檢測樣品的實際情況，本次使用檢測抗體標記的單陽樣品代入補償值驗證，對有明顯偏差的通道可手工微調，使補償與各單陽樣品標記吻合，再將修正的補償應用到多色數據上，即可獲得清晰的補償后數據。

本實驗采用優化的檢測參數一次完成9 色樣品的分析與補償，分析結果群體區分清晰，避免了傳統主觀調試的反復上樣調整，節省了細胞樣品，可以保證檢測通道達到理想的信噪比和分辨力，同時簡便可靠的計算補償，提高多色數據質量，方便操作者快速準確的完成多參數流式的檢測。

綜上所述，通過對相同光譜的一系列CD4 標記單陽參考樣品以遞增檢測參數重復分析，獲得各通道檢測器性能數據，依據流式細胞儀的檢測器性能特點，簡便快速的確定各通道最佳檢測參數，避免操作者主觀判斷失誤，結合自動補償和補償驗證步驟，確保準確合理的補償，提高流式多色數據分析的質量，使流式分析的結果更加準確、客觀，同時節省細胞樣品。