營(yíng)心寧膠囊通過MEK1調(diào)控肝X受體促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定與消退的機(jī)制*

廖艷林，朱 浩，朱根源，張 鵬

武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢430014

動(dòng)脈粥樣硬化是一種具有脂質(zhì)代謝紊亂的慢性炎癥性疾病［1］。其病變主要累及大、中動(dòng)脈。脂質(zhì)沉積在動(dòng)脈內(nèi)膜，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，纖維化和鈣化形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，導(dǎo)致動(dòng)脈腔狹窄和血管壁硬化。肝X受體是（liver X receptors，LXR）由配體（激動(dòng)劑）激活的轉(zhuǎn)錄因子［2］，它含有LXRα和LXRβ兩種異構(gòu)體，分別于1994年和1995年被發(fā)現(xiàn)。LXRα和LXRβ的異構(gòu)體在順序和結(jié)構(gòu)上高度相似。LXRα主要表達(dá)于肝臟、腎臟、小腸、脂肪組織、巨型睡眠細(xì)胞、脾臟和肺臟，LXRβ主要表達(dá)于所有組織和器官。兩者之間的配體結(jié)合能力沒有差異。LXR的生物學(xué)功能主要體現(xiàn)在膽固醇和脂肪的合成和代謝上。LXR激活一系列與膽固醇和脂肪合成與代謝有關(guān)的基因。LXR信號(hào)通路可顯著增加ABCA1和ABCG1的表達(dá)，從而增加膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)和LXR的抗炎作用。LXR配體在動(dòng)脈粥樣硬化的治療中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。營(yíng)心寧膠囊主要成份為丹參、槐花、川芎、三七、紅花、降香、赤芍，具有理氣止痛，活血化瘀之效。用于氣滯血瘀所致胸痹，癥見胸悶、胸痛、心悸、氣短。大量研究證實(shí)，該藥除可降低血壓外，還可通過益氣化痰，起到降低血脂及多種炎癥因子水平的作用，進(jìn)而對(duì)動(dòng)脈產(chǎn)生保護(hù)，而全身動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展與高血壓、高血脂及炎癥因子水平密切相關(guān)［3-5］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50只雌性C57BL/6（8周齡）小鼠，99只雌性ApoE-/-小鼠（24只制備膽固醇反向轉(zhuǎn)運(yùn)分析，75只進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)），均購(gòu)自上海亓上生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2021-0004。飼養(yǎng)條件：小鼠自由獲得維持飼料。在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)周期后，將預(yù)先配置好的食物粉放入小鼠飼養(yǎng)瓶中，根據(jù)小鼠體質(zhì)量給予食物。每只小鼠的攝食量約為體質(zhì)量的10%～15%。根據(jù)每個(gè)籠子中小鼠的數(shù)量，每2天更換新鮮食物，稱小鼠體質(zhì)量。

1.2 試藥及儀器營(yíng)心寧膠囊（貴陽新天藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：14000444136，規(guī)格：0.38 g/片）；高脂飼料（上海睿安生物科技有限公司，批號(hào)：310109004）；RPMI1640培養(yǎng)基（上海碧云天公司，批號(hào)：2018-AA5289）；總膽固醇（total cholesterol，TC）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天公司，批號(hào)：2019-DB1125）；低密度脂蛋白膽固醇檢測(cè)試劑盒（上海碧云天公司，批號(hào)：2018-PO3620）；高密度脂蛋白膽固醇檢測(cè)試劑盒（上海碧云天公司，批號(hào)：20199-BC0027）；血清甘油三酯（triglyceride，TG）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天公司，批號(hào)：2019-AS2955）；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天公司，批號(hào)：2019-XZ1129）；谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alsnine aminotransferase，ALT）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天公司，批號(hào)：2019-HB1029）；RT-1000型RT-PCR實(shí)時(shí)定量系統(tǒng)（南京中科拜爾醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）。

1.3 C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)

1.3.1 分組及處理 將50只雌性C57BL/6（8周齡）小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型組，營(yíng)心寧膠囊低、中、高劑量組，每組10只。模型組及營(yíng)心寧膠囊低、中、高劑量組以營(yíng)心寧膠囊添加量為0、1、3、9 mg/100 g的高脂飼料（21%脂肪，0.5%膽固醇）喂養(yǎng)2周；空白對(duì)照組喂以普通飼料。

1.3.2 腹腔巨噬細(xì)胞的提取C57BL/6小鼠8周齡時(shí)，每只小鼠腹腔注射3 mL 4%的賴氨酸乙酯。用普通飼料喂養(yǎng)5天后用頸椎脫臼法處死小鼠。用剪刀切開腹部，完全暴露腹膜。腹腔內(nèi)注射7 mL無菌的1×PBS，腹腔液吸入50 mL離心管內(nèi)。離心半徑15 cm，1500 r/min離心10 min，收集腹腔巨噬細(xì)胞。在含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中懸浮。1 h后更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天后，更換培養(yǎng)基并進(jìn)行藥物處理。

1.3.3 臟器組織采集 取C57BL/6（8周齡）小鼠肝臟、脾臟、腎臟、小腸和淋巴結(jié)。部分用4%聚甲酸切片固定組織，其余80℃保存。收集小鼠血清并進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定。

1.3.4 全動(dòng)脈油紅O染色 在解剖顯微鏡下仔細(xì)解剖C57BL/6（8周齡）小鼠主動(dòng)脈外脂肪和其他粘連的主動(dòng)脈組織。將主動(dòng)脈置于1 mL聚甲酸溶液中固定24 h以上，將整個(gè)主動(dòng)脈置于24孔板中的一個(gè)孔中。加入1 mL油紅O工作液，染色40～60 min。過量的染色液用60%異丙醇洗滌，直到部分主動(dòng)脈變白和半透明，斑塊區(qū)域明顯變紅。然后用蒸餾水沖洗3次。在顯微鏡下對(duì)主動(dòng)脈進(jìn)行再檢查，除去在主動(dòng)脈外染色的脂肪組織。顯微鏡下拍照并保存照片。用PS圖象處理軟件計(jì)算斑塊面積和主動(dòng)脈總面積，計(jì)算斑塊面積比例。

1.3.5 LXR表達(dá)量 通過q-RT-PCR對(duì)LXR mRNA表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。利用總RNA快速提取試劑盒提取總RNA，并使用miRNA特有的逆轉(zhuǎn)錄引物，將其與Super M-mLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反向轉(zhuǎn)錄。RT-PCR是在實(shí)時(shí)定量系統(tǒng)中上進(jìn)行。

1.3.6 生化指標(biāo) 室溫下對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行眼球取血，靜置2 h，2000 g離心20 min，取上清液。將血清用PBS稀釋至一定倍數(shù)。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行血清生化指標(biāo)TC、TG、AST、ALT的檢測(cè)。

1.4 ApoE-/-小鼠小鼠實(shí)驗(yàn)

1.4.1 分組及處理 選用8周齡雌性ApoE-/-小鼠24只，隨機(jī)分為對(duì)照組和營(yíng)心寧低、中、高膠囊組（U0：3 mg/100 g食物），每組6只。小鼠以正常食物喂養(yǎng)2周，在喂養(yǎng)的第9天，制備一組新的8周齡ApoE-/-小鼠，每只小鼠腹腔注射4%硫凝膠，第5天取出巨噬細(xì)胞后，裂解紅細(xì)胞。計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞并稀釋至2 mL無血清培養(yǎng)基中，加入最終濃度為50 ng/mL的clLDL和2 μCi/mL［3H］-膽固醇，37℃，CO2培養(yǎng)箱中標(biāo)記24 h。4組小鼠腹腔注射標(biāo)記細(xì)胞，每組注射2×l06細(xì)胞。注射后8、24、48 h收集小鼠糞便標(biāo)本。48 h后處死小鼠，收集血清、腹腔巨大溫血細(xì)胞和肝組織。提取樣品中的脂質(zhì)成分，用液體閃爍檢測(cè)器檢測(cè)各樣品中的3H放射性。

1.4.2 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊分析 采用高脂飼料喂養(yǎng)75只雌性ApoE-/-小鼠12周，隨機(jī)分成G1、G2、G3、G4、G5組，每組15只。使其動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展到中期，然后用藥物和改良的食物配方進(jìn)行治療。G1組高脂飼料喂養(yǎng)12周后取血清、主動(dòng)脈、肝臟等標(biāo)本；G2組高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)4周；G3組高脂飼料中添加營(yíng)心寧膠囊（3 mg/100 g飼料）；G4組動(dòng)物喂以基本維持飲食；G5組在維持飼料中添加營(yíng)心寧膠囊（3 mg/100 g飼料）。4周后處死G2-G5組小鼠，收集血清、主動(dòng)脈、肝臟、腹腔巨噬細(xì)胞等標(biāo)本。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究中數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 血清TC、TG水平 與空白組比較，營(yíng)心寧膠囊各劑量組TC水平提高（P＜0.05），與模型組比較，營(yíng)心寧膠囊高劑量組TC水平顯著降低（P＜0.05）。與空白組比較，營(yíng)心寧膠囊各劑量組TG水平均提高（P＜0.05），與模型組比較，營(yíng)心寧膠囊各劑量組TG水平均下降，且營(yíng)心寧膠囊高劑量組血清中TG水平下降（P＜0.05）。見表1。

表1 各組C57BL/6小鼠血清中TC、TG及LXR水平比較（±s）

表1 各組C57BL/6小鼠血清中TC、TG及LXR水平比較（±s）

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2.1.2 LXR表達(dá)量 與空白對(duì)照組比較，模型組、營(yíng)心寧膠囊低劑量組LXR mRNA表達(dá)量降低（P＜0.05），營(yíng)心寧膠囊中、高劑量組LXR mRNA表達(dá)量低于空白對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.1.3 血清ALT、AST水平 與空白對(duì)照組比較，其余各組ALT、AST水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，營(yíng)心寧膠囊各劑量組ALT、AST水平降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組C57BL/6小鼠ALT、AST水平比較（±s）U/L

表2 各組C57BL/6小鼠ALT、AST水平比較（±s）U/L

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2.1.4 肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn) 高脂食物可以使肝臟顏色變白，表明肝臟中脂質(zhì)含量的增加，LXR配體可以促進(jìn)肝臟變白，營(yíng)心寧膠囊可改善高脂食物所致的肝臟發(fā)白表現(xiàn)，表明營(yíng)心寧膠囊具有改善脂肪肝的作用。見圖1。

圖1 各組C57BL/6小鼠肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn)

2.1.5 肝臟組織油紅O染色結(jié)果 肝臟冷凍切片油紅O染色顯示，隨著營(yíng)心寧膠囊濃度的增加，肝臟脂質(zhì)積聚明顯減少，營(yíng)心寧膠囊消除了高脂飼料引起的肝臟脂質(zhì)積聚，見圖2。與模型組比較，營(yíng)心寧膠囊各劑量組TG含量均下降，且營(yíng)心寧膠囊高劑量組下降更明顯（P＜0.05）。見表3。

圖2 各組C57BL/6小鼠肝臟組織油紅O染色結(jié)果（×200）

表3 各組C57BL/6小鼠肝臟中TG水平比較（±s）mM

表3 各組C57BL/6小鼠肝臟中TG水平比較（±s）mM

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2.2 ApoE-/-小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 動(dòng)脈組織油紅O染色結(jié)果 對(duì)雌性ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織進(jìn)行油紅O染色，喂養(yǎng)高脂飲食12周后，主動(dòng)脈斑塊面積約占總主動(dòng)脈表面積的11%。持續(xù)喂養(yǎng)高脂飲食進(jìn)一步加劇斑塊的發(fā)展。16周后，總主動(dòng)脈斑塊面積約占主動(dòng)脈總面積的13%左右。喂養(yǎng)12周后，進(jìn)行干預(yù)，雌性ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成受到抑制。但單獨(dú)改善飲食結(jié)構(gòu)時(shí)，斑塊的發(fā)育不受影響。低脂低膽固醇飼料喂養(yǎng)時(shí)，用藥組小鼠的斑塊面積為9%左右，12周時(shí)斑塊面積小于初始面積的11%，表明用藥不僅抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，而且在粥樣硬化斑塊的消退中起到了一定的作用。見圖3、表4。

圖3 各組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織油紅O染色結(jié)果（×200）

2.2.2主動(dòng)脈根部斑塊面積 與主動(dòng)脈斑塊的形成相似，高脂飲食12周后主動(dòng)脈根部斑塊的面積約為34%，16周后增加到42%～44%。不同于整個(gè)主動(dòng)脈，在高脂飲食的情況下，用藥對(duì)雌性ApoE-/-小鼠有明顯的抑制作用。同樣，單一的飲食干預(yù)也不能阻止成熟斑塊的進(jìn)一步發(fā)展。然而，在健康飲食背景下，MEK1/2抑制使斑塊面積下降到約29%，低于12周的初始值。見表4。

2.2.3 肝臟TG含量 在雌性ApoE-/-小鼠中，即使在高脂飲食的情況下，G2-G5組肝臟中TG積累量減少。當(dāng)用正常飲食代替食物時(shí)，血清TG水平降低，肝臟TG水平低于G1組，并且用藥對(duì)TG水平無明顯影響。見表4。

表4 各組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊面積比及肝臟TG含量比較（±s）

表4 各組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊面積比及肝臟TG含量比較（±s）

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3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)之一［6］，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成是主動(dòng)脈血管隨病情進(jìn)展而發(fā)生炎癥、脂質(zhì)沉積、細(xì)胞壞死和纖維化的過程［7］。在細(xì)胞的分化和增殖中，ERK1/2起著重要的作用［8］。ERK1/2的活化依賴于上游激酶MEK1/2，因此，MEK1/2抑制劑是潛在的抗癌藥物。

有報(bào)道［9］指出，IL-13在其誘導(dǎo)的肺炎癥反應(yīng)和重建過程中特異性激活ERK1/2。抑制ERK1/2活性可降低IL-13激活的化學(xué)因子和MMP-2、MMP-9、MMP-12、MMP-14的表達(dá)［10］，ERK1/2在TNF-α誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中也起重要作用［11］。

TG是細(xì)胞中重要的能量物質(zhì)［12］，機(jī)體攝入的多余的能量以TG的形式儲(chǔ)存在肌肉和脂肪組織中［13］。有研究［14］表明，LXR能直接刺激SRBEPLc和FASN的表達(dá)，因此，LXR是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵因素。本研究表明，與模型組比較，營(yíng)心寧膠囊高劑量組血清中TC、TG水平顯著下降，且高劑量營(yíng)心寧膠囊可顯著降低高脂食物引起的血清TC、TG水平。

當(dāng)肝臟中TG代謝異常時(shí)，一方面，TG在肝臟中蓄積并引起肝臟脂肪損害［15］；另一方面，肝臟中v-LDL的合成會(huì)將TG排出循環(huán)系統(tǒng)，導(dǎo)致高TG血癥［16-17］。最新研究［18］表明，TG水平的升高與動(dòng)脈粥樣硬化脂質(zhì)顆粒和載脂蛋白Ⅱ的水平直接相關(guān)。本研究通過油紅O染色對(duì)肝臟冷凍切片進(jìn)行觀察，結(jié)果表明隨著營(yíng)心寧膠囊濃度的增加，肝臟脂質(zhì)積聚明顯減少，營(yíng)心寧膠囊消除了高脂飼料引起的肝臟脂質(zhì)積聚。與模型組比較，營(yíng)心寧膠囊各劑量組TG含量均出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，表明營(yíng)心寧膠囊不會(huì)引起高TG血癥、脂肪肝等副作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，模型組、營(yíng)心寧膠囊低劑量組LXR mRNA表達(dá)量降低，營(yíng)心寧膠囊中、高劑量組LXR mRNA表達(dá)量低于空白對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

MEK1/2抑制劑可增加巨噬細(xì)胞ABCAl和膽固醇流出物的表達(dá)，并與LXR配體有協(xié)同作用［19］。這表明MEK1/2抑制劑可以更廣泛地應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防和治療中。同時(shí)MEK1/2抑制劑可預(yù)防和治療ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化。MEK1/2抑制劑可消除LXR配體引起的脂肪肝和肝損害等副作用［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織進(jìn)行油紅O染色觀察，喂養(yǎng)高脂飲食16周后，總主動(dòng)脈斑塊面積約占主動(dòng)脈總面積的13%左右。喂養(yǎng)12周后，進(jìn)行干預(yù)，雌性ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成受到抑制。低脂低膽固醇飼料喂養(yǎng)時(shí)，營(yíng)心膠囊干預(yù)ApoE-/-小鼠12周時(shí)斑塊面積小于初始面積的11%，表明該藥不僅抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，而且在粥樣硬化斑塊的消退中起到了一定的作用。與主動(dòng)脈斑塊的形成相似，單一的飲食干預(yù)不能阻止成熟斑塊的進(jìn)一步發(fā)展，在健康飲食背景下，MEK1/2抑制使斑塊面積下降到約29%，低于12周的初始值。

綜上所述，MEK1/2抑制劑對(duì)肝X受體動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定與消退具有促進(jìn)作用。