水提法和醇提法對舒肝和絡醒脾方抗肝纖維化作用的影響*

張秋菊，王奎淞，孫墨晗，李婕妠，郭嘉琪，劉 靚，劉 靜，趙鯤鵬

(甘肅中醫(yī)藥大學， 甘肅 蘭州 730000)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是由各種原因引起的慢性肝損傷后，肝臟正常結(jié)構(gòu)被破壞而致的肝細胞外基質(zhì)的異常積聚。目前尚無療效確切的抗HF藥物，復方中藥因其多靶點、多途徑的作用特點在HF的防治上有著獨特的優(yōu)勢。肝纖維化屬中醫(yī)學“積聚”“癥積”“臌脹”范疇。綜合歷代醫(yī)家的認識，在氣血的關系上，慢性肝病的發(fā)生發(fā)展符合葉天士“初病在經(jīng)在氣，久病入血入絡”的病機演變推論。甘肅中醫(yī)藥大學國家級名老中醫(yī)周信有教授基于多年臨床經(jīng)驗和久病入絡理論，總結(jié)出了治療慢性肝病的舒肝化癥方，而舒肝和絡醒脾方是在其基礎上凝練而來，由醋柴胡、岷當歸、炙黃芪、莪術、鱉甲、枳椇子6味藥組成。臨床上，復方中藥多以水提法和醇提法提取后服用。水提法和醇提法是中藥提取最常用的兩種方法，分別代表了傳統(tǒng)水煎用藥和現(xiàn)代制劑工藝[1-3]。舒肝和絡醒脾方的水提物和醇提對肝纖維的治療是否有差異目前尚不明確。本實驗通過觀察水提和醇提兩種不同提取物對四氯化碳(CCL4)肝纖維化模型大鼠的作用，探討舒肝和絡醒脾方水提和醇提方式對其抗纖維化療效的影響。

1 材料與方法

1.1 動 物

無特定病原體(SPF)級Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(200±20) g，雌雄各半，購自甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心并飼養(yǎng)于此，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(甘)2015-0002，動物使用許可證號為SYXK(甘)2015-0005。

1.2 藥物、試劑與儀器

舒肝和絡醒脾方處方：醋柴胡10 g，岷當歸15 g，炙黃芪12 g，莪術12 g，鱉甲10 g，枳椇子10 g。藥材購自甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科，并經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室鑒定。舒肝和絡醒脾方水提法按臨床用藥比例取單味藥物混合，加5倍量水，不浸泡，回流提取0.5 h，趁熱過濾；藥渣再加4倍水回流提取0.5 h，趁熱過濾；合并濾液；濃縮，使生藥含量為 2 g/L。醇提法按方取單味藥物混合浸泡，加10倍量體積分數(shù)為 700 mL/L乙醇，不浸泡，回流提取1.5 h，趁熱過濾；藥渣再加8倍量 700 mL/L 乙醇煎煮1.5 h，趁熱過濾；合并濾液；濃縮，使生藥含量為2 g/L。秋水仙堿片，西雙版納藥業(yè)有限責任公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號180101，0.5 mg/片。用研缽將秋水仙堿片磨碎，以生理鹽水溶解，使其質(zhì)量分數(shù)為 0.1 g/L。食用橄欖油，山東魯花集團有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號為GB/T23347；CCl4分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號20120211；透明質(zhì)酸酶(HA)和IV型膠原(CIV)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，均為江蘇菲亞生物科技有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號依次為MM-0853R1、MM-0296R1；Masson三色染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號G1340；Infinite M200 Pro酶標儀，奧地利TECAN公司產(chǎn)品；TC6010L全自動生化分析儀，江西特康科技有限公司產(chǎn)品；ASP200S全自動組織脫水機和RM2235型切片機，均為德國Leica公司產(chǎn)品；BX51M顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)，日本OLYMPUS株式會產(chǎn)品。

1.3 分組與造模

將40只大鼠分為正常對照組、模型對照組、秋水仙堿組、疏肝活絡醒脾方水提組和疏肝活絡醒脾方醇提組5組，每組8只。適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。造模開始第1天，除正常對照組外，其余各組大鼠均腹腔注射體積分數(shù)為400 mL /L 的CCl4橄欖油溶液，注射劑量2.0 μL/g體質(zhì)量，每周3次，至第8周末[4-7]。

1.4 給藥方法

從造模第2天開始給藥，1 d 1次至第8周末。參考《實驗藥理方法學》[8]按體表面積換算大鼠灌胃劑量。舒肝和絡醒脾方水提組和醇提組分別給予水提物和醇提物，以4倍等效劑量28.75 g/kg體質(zhì)量灌胃；秋水仙堿組用秋水仙堿溶液5.0 μL/g體質(zhì)量灌胃；模型對照組以等量生理鹽水灌胃；正常對照組不做任何處理。各組均正常喂食喂水。

1.5 檢測指標

1.5.1 取 材

于第8周末當晚，大鼠禁食不禁水12 h，次日上午稱量體質(zhì)量后，用20 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，剝離腹主動脈，以真空采血管腹主動脈取血，靜置 2 h，離心，取血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ「闻K，以4 ℃生理鹽水沖洗，去除薄膜和殘留組織，稱量質(zhì)量；取肝臟中葉，于肝右葉離邊緣1 cm處切取大小為1 cm×1 cm×0.1 cm的肝組織，以質(zhì)量分數(shù)為40 g/L的甲醛固定。

1.5.2 肝指數(shù)

肝指數(shù)(%)=肝質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%[9-11]。

1.5.3 肝纖維化血清學指標

取大鼠血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清HA、CIV水平。

1.5.4 肝臟功能血清學指標

采用全自動生化儀以賴氏法檢測各組血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的含量。

1.5.5 肝臟結(jié)構(gòu)觀察及纖維化程度評估

甲醛固定的肝臟組織經(jīng)脫水、包埋、切片后，以Masson染色，光鏡下每張切片選取10個不同視野，觀察肝小葉結(jié)構(gòu)、纖維間隔、炎細胞浸潤等情況，對肝纖維化程度進行評估。切片用雙盲法由3位病理醫(yī)師評估。肝纖維化分期參照2002年肝纖維化診斷評估標準[12-13]。0期：無纖維化。1期：匯管區(qū)纖維化擴大，局限于竇周和小葉內(nèi)纖維化。2期匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留。3期：纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化。4期：早期肝硬化。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝指數(shù)對比

與正常對照組對比，模型對照組肝指數(shù)升高，3個藥物組的肝指數(shù)均下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。舒肝和絡醒脾方水提組與醇提組的肝指數(shù)對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肝指數(shù)對比

2.2 各組大鼠血清HA、CIV水平對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠血清中HA、CIV水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比，3個藥物組大鼠血清HA、CIV均下降(P<0.05)。與秋水仙堿組對比，舒肝和絡醒脾方水提組大鼠血清HA水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而水提組的CIV及醇提組的HA、CIV水平降低，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。舒肝和絡醒脾方水提和醇提組兩組間對比，血清HA水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而血清CIV水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠HA、CIV水平對比

2.3 各組大鼠ALT、AST水平對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠血清ALT、AST水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比，3個藥物組大鼠血清ALT、AST水平均降低(P<0.05)。3個藥物組之間的兩指標對比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠ALT、AST水平對比

2.4 各組大鼠肝纖維化程度對比

Masson染色后增生的膠原纖維呈現(xiàn)亮藍色。光鏡下，正常對照組大鼠肝臟小葉輪廓清晰，肝細胞索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，竇周和小葉內(nèi)未見纖維間隔。模型對照組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，竇周和小葉內(nèi)可見明顯纖維間隔形成，纖維間隔分割肝小葉，肝細胞脂肪變、壞死明顯。3個藥物組大鼠肝臟小葉結(jié)構(gòu)逐漸恢復，纖維分割明顯減少，肝細胞脂肪變、壞死減輕，舒肝和絡醒脾方水提組和醇提組尤為明顯。見圖1。

A.正常對照組:肝臟結(jié)構(gòu)正常，肝小葉輪廓清晰，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀排列。B.模型對照組：肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，纖維間隔分割肝小葉，肝細胞脂肪變、壞死明顯。C.秋水仙堿組：肝臟結(jié)構(gòu)紊亂減輕，分割肝小葉的纖維間隔減少，肝細胞脂肪變、壞死減輕。D.舒肝和絡醒脾方水提組：肝臟結(jié)構(gòu)紊亂明顯減輕，纖維間隔基本消失。E.疏肝和絡醒脾方醇提組：肝臟結(jié)構(gòu)紊亂有所減輕，偶見纖維間隔。黑色箭頭所示為纖維間隔。

根據(jù)Masson染色結(jié)果，參照2002年肝纖維化診斷評估標準，對肝纖維化程度進行量化，結(jié)果顯示：與正常對照組對比，模型對照組大鼠肝臟纖維化程度加重，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比，3個藥物組大鼠肝臟纖維化程度均減輕(P<0.05)。舒肝和絡醒脾方水提和醇提組大鼠肝臟纖維化程度對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠肝纖維化程度對比 只

3 討 論

實驗研究發(fā)現(xiàn)，舒肝和絡醒脾方具有明顯的改善肝纖維化的功效[14-17]。本實驗分別采用水提法和醇提法提取舒肝和絡醒脾方的有效成分，觀察其對CCl4所致HF模型大鼠肝臟形態(tài)和功能的影響，對兩種提取物的抗肝纖維化功效進行了比較。中藥水提法即傳統(tǒng)煎煮法，指利用水的溶解性將中草藥中親水性的有效成分溶解出來，因其符合中醫(yī)傳統(tǒng)用藥習慣，制備方法簡單易行，是中藥提取中應用最早也是至今應用最為廣泛的方法；但由于其提取成分復雜、雜質(zhì)多、有效成分損失多(尤其是脂溶性成分)等缺點，為中藥精制帶來了一定困難。醇提法多指利用乙醇的溶解性，將乙醇作為溶劑對物質(zhì)進行分離提純的方法。乙醇的溶解性能比較好，對中草藥細胞的穿透能力較強，彌補了水提法的一些不足之處[18-19]。

肝指數(shù)是衡量肝臟大小的指標，血清HA和CIV是評估肝纖維化程度最為敏感的血清學指標，血清ALT、AST水平是評估肝臟功能的常用指標，肝臟的HE和Masson染色是從形態(tài)學角度對肝纖維化程度進行評估。本實驗結(jié)果顯示：肝指數(shù)、血清學指標HA、CIV、ALT、AST含量及肝纖維化程度方面，與模型對照組對比，舒肝和絡醒脾方水提組和醇提組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而水提組與醇提組之間對比，雖然HA、ALT和AST差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但數(shù)值向反方向背離(如水提組降低AST的效果不及醇提組，但醇提組降低ALT的效果不及水提組)，因此，此數(shù)據(jù)無法證明兩組間治療效果的差異。結(jié)果表明：舒肝和絡醒脾方水提物和醇提物對肝纖維化均有明顯療效，不同提取方法對其療效無明顯影響。

水提法和醇提法對舒肝和絡醒脾方療效無明顯影響，但是其有效成分目前仍未明確，治療肝纖維化的機制還處于探索階段，因此，還需進一步深入研究以明確其有效成分及作用機制[20]。