疏肝化積湯對肝癌荷瘤小鼠CD4+CXCR5+ T細胞亞群和IL-6、IL-21、CXCR5的影響*

王 珍，鄒鳳嬌，駱敏翔，錢國強，趙昌林

(1.廣東祈福醫院， 廣東 廣州 511495； 2.廣東藥科大學健康學院，廣東 廣州 510006)

肝癌是發病率和病死率均較高的惡性腫瘤，每年我國有38.3萬例患者死亡，占世界肝癌死亡人數的51%[1]，目前病死率仍持續上升[2]。肝癌的治療方法包括手術治療、介入治療、靶向藥物和免疫藥物治療等。針對肝癌癌前病變的干預和術后康復仍缺乏有效的措施，而中醫藥防治起著重要的作用[3]。中醫藥可調節機體內環境，重塑腫瘤免疫微環境。中藥可調節主要組織相容性復合體(MHC)分子和Fas抗原/Fas抗原配體的表達，減弱腫瘤干細胞的致癌能力，促進樹突狀細胞成熟，調節輔助性T細胞1(Th1)/輔助性T細胞2(Th2)的平衡[4]。濾泡輔助性T細胞(Tfh)是CD4+T效應細胞亞群之一， CD4和趨化因子受體5(CXCR5)是其主要標記，參與慢性感染、B細胞免疫等過程，對感染性疾病的體液免疫起決定性調節作用；同時在自身免疫和腫瘤發生等疾病中具有重要作用，可激活抗腫瘤免疫細胞，增強機體的抗腫瘤作用。CXCR5是Tfh細胞表達的特有受體，Tfh 細胞通過分泌白細胞介素(IL)-21和IL-6，在促進B細胞免疫和抗腫瘤中起關鍵作用。臨床研究表明：免疫激活和免疫耐受患者外周血中CD4+CXCR5+T細胞數量及IL-21水平明顯升高[5-6]；慢性乙肝患者外周血中CD4+CXCR5+T細胞升高，且與乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)載量呈負相關[7]。本研究觀察了疏肝化積湯對肝癌移植瘤小鼠CD4+CXCR5+T細胞亞群和IL-6、IL-21、CXCR5的影響，探討其治療肝癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

無特定病原體(SPF)級C57BL/6小鼠40只，35～42 d齡，體質量(20±3)g，雌雄各半，購自廣東省醫學實驗動物中心，動物生產許可證號為SCXK(粵)2013-0034，動物使用許可證號為44007200010001。適應性飼養1周，實驗過程均遵守科技部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定。本實驗經廣東祈福醫院倫理委員會批準。

1.2 細 胞

H22肝癌細胞株，購自廣東省醫學實驗動物中心。

1.3 藥品、試劑與儀器

疏肝化積湯組成：柴胡10 g，黨參10 g，制附片5 g，女貞子20 g，細辛5 g，桃仁10 g，紅花10 g，桂枝10 g，半枝蓮30 g等。藥物由廣東祈福醫院制劑室提供并鑒定，使用前制成流浸膏，每毫升含生藥0.87 g。順鉑注射粉針劑，山東齊魯制藥有限公司產品，產品批號6J015A89，10 mg/支。CD4(批號15004281)、CXCR5(批號25918541)，均為美國eBioscience公司產品；反轉錄試劑iScript cDNA synthesis kit，美國BIO-RAD公司產品，批號1708890；定量PCR試劑ABI Power SYBR Green PCR Master Mix，美國ABI公司產品，批號1708891；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒，北京百奧萊博科技有限公司，批號1708891BUN；IL-6、IL-21、CXCR5酶聯免疫吸附試驗試劑盒，上海聯科生物科技公司產品，批號依次為118041125,226536078,540219677。PT-3502全自動酶標儀，北京普天技術有限公司產品；Ts2R/Ts2RFL倒置型熒光顯微鏡、成像系統，均為日本尼康公司產品；FACSCanto流式細胞儀，美國BD公司產品；ABI 7900 HT Sequence Detection System，美國Servicebio公司產品；包埋機，武漢俊杰電子有限公司產品。

1.4 模型的建立

將H22肝癌細胞株接種于C57BL/6小鼠腹腔，5 d后形成腹水；取乳白色腹水離心，調整細胞濃度為1×107/mL；取0.1 mL懸浮液接種于C57BL/6小鼠左側胸部，形成肝癌移植瘤。接種5 d后，局部見硬性突起移植瘤，通過組織病理學檢測，證實造模是否成功。

1.5 動物分組與給藥

按隨機數字表法將小鼠分為空白對照組、模型對照組、順鉑組和疏肝化積湯組，每組10只?？瞻讓φ战M不進行干預，其他3組小鼠左側胸部接種肝癌移植瘤。在造模成功48 h后開始給藥，空白對照組、模型對照組給予生理鹽水灌胃，5 μL/g體質量，1次/d，連續14 d；順鉑組給以順鉑腹腔注射，4 μg/g體質量，1次/d，連續3 d后停止給藥。疏肝化積湯組給予疏肝化積湯5 μL/g體質量灌胃，連用14 d。

1.6 檢測指標

14 d后斷頸處死動物，摘除眼球取血，無菌狀態下分離脾臟，剝離腋下腫瘤組織，進行檢測。

1.6.1 一般情況

每天稱量各組小鼠體質量，觀察小鼠進食量、活動度、毛發及精神狀態等。

1.6.2 瘤體生長情況

稱量移植瘤的質量，并進行石蠟切片、蘇木精-伊紅染色，觀察各組小鼠移植瘤的組織病理學變化。

1.6.3 血清IL-6、IL-21和CXCR5水平

采用酶聯免疫吸附法檢測。收集血清標本離心，加樣，用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min，洗滌，每孔加入酶標試劑50 μL，溫育，顯色，每孔加終止液50 μL終止反應，上機測定。

1.6.4 脾淋巴細胞中CD4+CXCR5+T細胞亞群的數量

采用流式細胞學技術檢測。脾臟剪碎，200目細胞篩上適度研磨。收集細胞混合液，以6 cm為離心半徑、1 500 r/min轉速離心15 min。將裂解后的懸浮細胞緩慢加在淋巴細胞分離液上。取中間的淋巴細胞，計數，定容量至1×107/mL，加1.25 μL熒光染料APC標記的CD4抗體(CD4-APC)和1.25 μL熒光染料PE標記的CXCR5抗體(CXCR5-PE)，室溫避光孵育30 min。另取樣品加入5 μL熒光染料PE標記的CD90抗體(CD90-FE)、5 μL熒光染料PE標記的免疫球蛋白G (IgG-PE)進行對照，室溫避光孵育30 min，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次。24 h內上機檢測。

1.6.5 移植瘤中IL-6、IL-21和CXCR5的基因檢測

采用實時定量熒光聚合酶鏈反應(PCR)檢測，管家基因為β-actin，以ΔCt = Ct靶基因-Ct管家基因方法計算IL-6、IL-21和CXCR5基因的相對表達水平。引物由上海生工生物工程有限公司合成。常規提取H22肝癌移植瘤的核糖核酸(RNA)凍存。取出RNA，4 ℃下解凍，在0.2 mL PCR管中配制。將PCR管置于25 ℃ 5 min，42 ℃孵育30 min，85 ℃變性5 min，4 ℃保溫。將PCR管置于PCR儀中進行反應，50 ℃孵育2 min，然后95 ℃孵育10 min；接著進行40個循環(95 ℃，15 s；60 ℃，1 min)；最后進行數據分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 統計學方法

2 結 果

2.1 各組小鼠一般情況對比

與模型對照組小鼠對比，疏肝化積湯組小鼠毛發光亮，能維持正常體質量和食欲，活動程度尚可。與空白對照組小鼠對比，疏肝化積湯組小鼠體質量、進食量、毛發和精神狀態相似，但活動度有所減少。順鉑組小鼠明顯消瘦，脫毛，進食量減少，活動度差。模型對照組進食量、活動度、毛發和精神狀態介于疏肝化積湯組和順鉑組之間。

2.2 移植瘤的組織病理學變化及各組小鼠瘤體質量對比

移植瘤的組織病理學檢查顯示：細胞體積較大；核大深染，核仁清晰可見，核分裂現象多見；胞漿少，呈暗色嗜酸性染色，證實為H22肝癌移植瘤。與模型對照組對比,順鉑組和疏肝化積湯組的瘤體質量減少，差異有統計學意義(P<0.05)。疏肝化積湯組的瘤體質量與順鉑組對比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。結果表明：順鉑與疏肝化積湯均可抑制H22肝癌移植瘤的生長，兩者的抑制作用無顯著差異。

表2 各組小鼠瘤體質量對比

2.3 各組小鼠血清中IL-6、IL-21和CXCR5水平對比

與模型對照組、順鉑組和空白對照組對比，疏肝化積湯組小鼠血清中IL-6、IL-21和CXCR5水平升高，除CXCR5水平與模型對照組差異無統計學意義外，其他對比差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。與模型對照組對比，順鉑組的IL-6和CXCR5水平下降，IL-21水平升高，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表3。結果表明:H22肝癌移植瘤的形成引起小鼠免疫反應，表現為血清IL-6和CXCR5的水平升高；免疫細胞分泌功能下降，出現IL-21下降。疏肝化積湯可提高血清IL-6、IL-21和CXCR5的水平，而順鉑使血清IL-6和CXCR5的水平降低。兩者的治療作用機制不同。

表3 各組小鼠血清中IL-6、IL-21和CXCR5水平對比

表3 各組小鼠血清中IL-6、IL-21和CXCR5水平對比

組 別IL-6IL-21CXCR5空白對照組57.33±12.03 13.73±2.055.84±2.73 模型對照組106.15±23.7812.71±2.7810.76±3.65順鉑組81.87±22.85??19.81±3.82???6.17±2.85???疏肝化積湯組143.23±42.15???###△△△39.43±12.23???###△△△14.33±4.15?###△△△

注：與模型對照組對比，* P>0.05，**P<0.05，***P<0.01；與順鉑組對比，# P>0.05，## P<0.05，### P<0.01；與空白對照組對比，△△△ P<0.01。

2.4 各組小鼠脾淋巴細胞中CD4+CXCR5+ T細胞亞群數量對比

與模型對照組、順鉑組和空白對照組對比，疏肝化積湯組CD4+CXCR5+T細胞亞群的數量升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，順鉑組CD4+CXCR5+T細胞亞群的數量下降，差異有統計學意義(P<0.01)。見表4。結果表明： H22肝癌移植瘤的形成引起小鼠免疫反應，CD4+CXCR5+T細胞的數量升高；疏肝化積湯可提高小鼠的免疫功能，表現為脾臟CD4+CXCR5+T細胞亞群數量的顯著增加；而順鉑可導致其數量下降。

表4 各組小鼠脾淋巴細胞中CD4+CXCR5+ T細胞亞群數量對比

2.5 各組小鼠移植瘤中IL-6、IL-21和CXCR5基因表達對比

與模型對照組對比，疏肝化積湯組IL-6、IL-21和CXCR5的基因表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與順鉑組對比，疏肝化積湯組IL-6、IL-21和CXCR5的基因表達升高，差異有統計學意義(P<0.01)。見表5。結果表明：經過疏肝化積湯治療，H22肝癌移植瘤中IL-6、IL-21和CXCR5的表達升高，而順鉑治療后腫瘤微環境中IL-6、IL-21和CXCR5的表達降低。兩者治療作用機制不同。

表5 各組小鼠移植瘤中IL-6、IL-21和CXCR5基因表達對比

3 討 論

中醫藥可延緩惡性腫瘤的進展，延長生存時間，提高生活質量。本實驗結果顯示，疏肝化積湯可保持小鼠毛發光亮，維持正常體質量、食欲和良好的活動度，可抑制H22肝癌移植瘤生長，治療效果與順鉑相似。

目前，中醫藥治療肝癌的作用機制研究主要在誘導細胞凋亡和提高免疫功能等方面，如:白藜蘆醇可誘導HepG2細胞凋亡[8]，熊果酸、芍藥醇、藤黃酸可抑制人肝癌細胞生長并誘導凋亡[9-11]，復方制劑能夠提高免疫抑制小鼠的體液免疫和細胞免疫反應[12]。在本項研究中，H22肝癌移植瘤形成時，小鼠脾臟CD4+CXCR5+T細胞亞群的數量升高，血清IL-6和CXCR5的水平升高，屬于免疫反應；而IL-21出現下降，提示CD4+CXCR5+T細胞的功能受到抑制；疏肝化積湯可以提高小鼠脾臟CD4+CXCR5+T 細胞亞群的數量，血清IL-6、IL-21和CXCR5的水平也顯著升高；而使用順鉑化療后，肝癌移植瘤小鼠的免疫功能受抑，CD4+CXCR5+T 細胞亞群的數量下降，血清IL-6和CXCR5的水平降低。表明順鉑和疏肝化積湯的治療作用機制不同，疏肝化積湯以提高免疫功能為主。

在肝癌移植瘤微環境中，疏肝化積湯可提高IL-6、IL-21和CXCR5的基因表達。CD4+CXCR5+T細胞表達CXCR5和Bcl-6，主要分泌IL-21[13]。CD4+CXCR5+T細胞是抗原特異性B細胞反應的重要調節因子，B細胞趨化劑CXCL13與CD4+CXCR5+T細胞在腫瘤微環境中浸潤，可提高癌癥生存率[14]。Tfh細胞參與抗腫瘤免疫反應，甲狀腺癌遠處轉移患者血清中的IL-10、IL-21和CXCL13的表達明顯低于健康對照人群和局部疾病患者，遠處轉移者血液循環中的Tfh細胞對B細胞生長和IgM分泌的支持能力較差。CD4+CXCR5+T細胞亞群功能缺陷，惡性腫瘤易出現轉移[15]。研究表明，白術、黃芪、黨參、柴胡等可提高機體免疫力，黃芪甲苷可顯著抑制HBV抗原的分泌，對HBsAg、HBeAg均有明顯的抑制作用[16]。本實驗中結果表明：疏肝化積湯可以提高肝癌移植瘤中IL-21、IL-6、CXCR5的基因表達，使CD4+CXCR5+T細胞在肝癌免疫微環境中浸潤，改善腫瘤的免疫微環境，起到抗腫瘤作用；而順鉑則起到抑制作用，使CD4+CXCR5+T細胞在腫瘤免疫微環境中減少。

綜上所述，疏肝化積湯可提高CD4+CXCR5+T細胞亞群的數量和功能，改善腫瘤免疫微環境，從而起到抗腫瘤作用。