從調控血管內皮生長因子及其受體激活Notch信號通路角度探討生地梓醇促血管新生及神經功能重塑作用

孫立平，周霞，劉炬，張佳樂，王祥煜，郭炳杉，劉偉

腦卒中具有高發病率、高死亡率和高致殘率等特點，其已成為我國成年人致死、致殘的首位病因［1］。在針對錯失溶栓治療時間窗的腦梗死患者的藥物治療中，神經保護劑仍未取得高質量研究證據與強推薦，因而具有活血化瘀功效的中藥及其組分在腦卒中的早期干預中具有重要臨床意義［2］。地黃是治療中風經典方劑中的常用藥物之一，如地黃飲子、血府逐瘀湯等，生地梓醇作為小分子環烯醚萜葡萄糖苷類化合物，是其主要功效組分之一。有研究者認為，生地梓醇通過上調血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達水平而發揮促血管新生作用，但VEGF能增加血管通透性，進而加重組織水腫［3］。而只有新生血管成熟為穩定的微血管網時，其血管穩定性才增加，組織水腫才不加重，而Notch信號通路可通過參與內皮細胞的增殖以及細胞相互作用而維持血管穩定［4］。本研究擬從調控VEGF及血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）激活Notch信號通路角度，探討生地梓醇促血管新生及神經功能重塑的作用機制，實證《神農本草經》關于生地“干地黃，主折跌絕筋，傷中，逐血痹，填骨髓，長肌肉……除痹，生者尤良”的功效記載［5-6］，以期為臨床轉化提供更多證據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取SPF級雄性SD大鼠31只，平均體質量（220±20）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。動物合格證號：SCXK（魯）2019-0003。動物適應環境：溫度21～25 ℃，日溫差±1 ℃，濕度50%～70%，普通飼料喂養。

1.2 實驗藥物 生地梓醇購自上海源葉生物科技有限公司（純度≥98%，相對分子量為362.33），以終濃度為1 mg/ml的生地梓醇溶液作為神經保護的最佳濃度［7］。

1.3 實驗儀器與試劑 高速低溫組織研磨儀（KZ-Ⅲ-F）購自Servicebio公司，臺式高速冷凍型離心機（0004219-11）購自德國Hettichi公司，熒光定量PCR儀（CFX connect）購自上海土森視覺科技有限公司，超純RNA提取試劑盒（CW0581M）、TRIzon Reagent（CW0580S）購自康為世紀，三氯甲烷（10006818）、異丙醇（80109218）、無水乙醇（10009218）購自國藥集團化學試劑有限公司，SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒（AG11701）、Evo M-MLV反轉錄試劑預混液（AG11706）購自艾科瑞生物。

1.4 實驗時間 本實驗時間為2019年7月至2021年1月。

1.5 實驗方法

1.5.1 分組及干預方法 將24只大鼠隨機分為生地梓醇組、生理鹽水組、假手術組，各8只。生地梓醇組、生理鹽水組大鼠參照Longa改良線栓法［8］進行腦卒中造模，具體如下：腹腔注射10%水合氯醛（0.40 ml/100 g）麻醉大鼠，而后于頸部正中切口，分離出右側頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）和頸內動脈（internal carotid artery，ICA）；結扎ECA遠心端和CCA，再使用動脈夾夾閉ICA；距離CCA分叉3 mm處剪一個“V型”切口，將尼龍線栓（直徑為0.33 mm）從小口小心插入，深度18～20 mm，以阻斷血流，然后常規縫合頸部創口，預留線栓于皮膚外，整個手術過程中注意保暖。假手術組接受與造模相同的頸動脈分離，但不插入尼龍線栓。大鼠清醒后2 h采用Longa 5分法進行神經功能評分，0分為無神經損傷癥狀，1分為不能完全伸展對側前爪，2分為向對側轉圈，3分為向對側傾倒，4分為不能自發行走、意識喪失；評分1～3分視為造模成功［8］。剔除神經功能評分為0、4分或在手術過程中死亡的大鼠，然后重新選取大鼠進行造模，補充到相應組別中，保證每組動物數量始終為8只。腦卒中大鼠造模成功后24 h，生地梓醇組大鼠腹腔注射生地梓醇溶液（9 mg/kg），生理鹽水組和假手術組大鼠均腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續7 d。

1.5.2 評估神經功能評分 分別于造模后1、5、8 d評估各組大鼠神經功能評分，采用Longa 5分法進行神經功能評分［8］，評分越高表示大鼠神經功能損傷越嚴重。

1.5.3 評估平衡木實驗評分 分別于造模后1、5、8 d對各組大鼠進行平衡木實驗。實驗方法：將一長1.0 m、寬1.5 cm的方形平衡木一端搭在黑色方盒內，另一端懸空。將大鼠放在平衡木的懸空端，木條下放上軟墊以保護大鼠，防止跌傷。記錄大鼠進入黑色方盒內所花時間，根據時間長短進行0～5分的評分，評分標準按Longa 5分法［8］及Bederson 5分制法［9］。若超過60 s未能到達黑色方盒，則記錄為60 s。評分越高，說明大鼠行為障礙越嚴重。

1.5.4 觀察病灶區腦組織形態 于造模后第8天完成神經功能評分及平衡木實驗后，各組分別取3只大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，處死大鼠并取腦組織進行TTC染色，觀察病灶區腦組織形態。

1.5.5 檢測腦組織VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4 mRNA相對表達量 于造模后第8天完成神經功能評分及平衡木實驗后，各組分別取剩余的5只大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，處死大鼠并取腦組織，提取總RNA。取2.5 μl反轉錄產物進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），以GAPDH為內參基因。按照試劑盒說明書建立體積為25.0 μl的PCR反應體系，其中2×實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）Mix 12.5 μl、7.5 μmol/L 基 因引物2.0 μl、反轉錄產物2.5 μl、雙蒸水8.0 μl。PCR步驟：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共44個循環。VEGF正向引物為5'-CGACAGAAGGGGAGCAGAAA-3'，反向引物為5'-GCTGGCTTTGGTGAGGTTTG-3'；VEGFR正 向 引物為5'-AGATCCCCGACTCCCTTTGA-3'，反向引物為5'- CACCAACTCTGAAAACGCGG-3'；Notch1正 向 引物為5'-TTGGTCCGAGGGCATCTCTA-3'，反向引物為5'-ACAGAGCTTGGGAACGGAAG-3'；Notch4正 向 引物為5'-GTCCCCTTAAACTCGGGTGG-3'，反向引物為5'-TCCTCTTGGAGCTGCCCTAT-3'；GAPDH正向引物為5'-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3'，反向引物為5'-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3'。采用2-ΔΔCt法 計 算 VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4 mRNA相對表達量。

1.6 統計學方法 使用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。服從正態分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；重復測量資料比較采用雙因素重復測量方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠不同時間神經功能評分比較 干預方法與時間在神經功能評分上存在交互作用（P＜0.05）；干預方法、時間在神經功能評分上主效應顯著（P＜0.05）。生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后1、5、8 d神經功能評分高于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）；生地梓醇組大鼠造模后5、8 d神經功能評分低于生理鹽水組，差異有統計學意義（P＜0.05）。生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后5、8 d神經功能評分分別低于本組造模后1 d，差異有統計學意義（P＜0.05）；生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后8 d神經功能評分分別低于本組造模后5 d，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組大鼠不同時間神經功能評分比較（±s，分，n=8）Table 1 Comparison of neural function scores in the three groups at different time

表1 三組大鼠不同時間神經功能評分比較（±s，分，n=8）Table 1 Comparison of neural function scores in the three groups at different time

注：a表示與假手術組比較，P＜0.05；b表示與生理鹽水組比較，P＜0.05；c表示與本組造模后1 d比較，P＜0.05；d表示與本組造模后5 d比較，P＜0.05

images/BZ_71_189_969_1192_1028.png假手術組 0.45±0.07 0.57±0.11 0.52±0.03生理鹽水組 4.36±0.11a 3.22±0.04ac 2.08±0.06acd生地梓醇組 4.23±0.04a 2.55±0.55abc 1.38±0.02abcd F值 F交互=1 982.53，F組間=17 562.96，F時間=6 833.08 P值 P交互＜ 0.001，P組間＜ 0.001，P時間＜0.001

2.2 三組大鼠不同時間平衡木實驗評分比較 干預方法與時間在平衡木實驗評分上存在交互作用（P＜0.05）；干預方法、時間在平衡木實驗評分上主效應顯著（P＜0.05）。生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后1、5、8 d平衡木實驗評分高于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）；生地梓醇組大鼠造模后5、8 d平衡木實驗評分低于生理鹽水組，差異有統計學意義（P＜0.05）。生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后5、8 d平衡木實驗評分分別低于本組造模后1 d，差異有統計學意義（P＜0.05）；生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后8 d平衡木實驗評分分別低于本組造模后5 d，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組大鼠不同時間平衡木實驗評分比較（±s，分，n=8）Table 2 Comparison of balance beam test scores in the three groups at different time

表2 三組大鼠不同時間平衡木實驗評分比較（±s，分，n=8）Table 2 Comparison of balance beam test scores in the three groups at different time

注：a表示與假手術組比較，P＜0.05；b表示與生理鹽水組比較，P＜0.05；c表示與本組造模后1 d比較，P＜0.05；d表示與本組造模后5 d比較，P＜0.05

images/BZ_71_1276_1094_2279_1158.png假手術組 0.12±0.04 0.14±0.07 0.12±0.04生理鹽水組 4.35±0.72a 2.25±0.46ac 1.13±0.64acd生地梓醇組 4.38±0.11a 1.38±0.52abc 0.63±0.52abcd F 值 F交互=417.57，F組間=2 971.73，F時間=1 608.87 P 值 P交互＜0.001，P組間＜0.001，P時間＜ 0.001

2.3 三組大鼠病灶區腦組織形態 假手術組大鼠無腦梗死現象，見圖1A；生理鹽水組大鼠仍有腦梗死現象，見圖1B；生地梓醇組大鼠仍存在腦梗死現象，但梗死范圍較生理鹽水組減小，腦組織缺血再灌注恢復及組織形成情況明顯優于生理鹽水組，見圖1C。

圖1 三組大鼠病灶區腦組織形態（TTC染色）Figure 1 Brain tissue morphology of lesion area in the three groups

2.4 三組大鼠腦組織VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4 mRNA相對表達量比較 三組大鼠腦組織VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4 mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。生地梓醇組大鼠腦組織VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4 mRNA相對表達量高于假手術組、生理鹽水組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 三組大鼠腦組織VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4 mRNA相對表達量比較（± s，n=5）Table 3 Comparison of the relative expression of VEGF，VEGFR，Notch1，Notch4 mRNA in the brain tissue of rats in the three groups

表3 三組大鼠腦組織VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4 mRNA相對表達量比較（± s，n=5）Table 3 Comparison of the relative expression of VEGF，VEGFR，Notch1，Notch4 mRNA in the brain tissue of rats in the three groups

注：a表示與假手術組比較，P＜0.05；b表示與生理鹽水組比較，P＜0.05；VEGF=血管內皮生長因子，VEGFR=血管內皮生長因子受體

組別 VEGF mRNA VEGFR mRNA Notch1 mRNA Notch4 mRNA假手術組 0.96±0.18 0.91±0.20 0.92±0.26 1.18±0.38生理鹽水組 0.99±0.08 1.00±0.12 1.04±0.11 1.04±0.10生地梓醇組 2.28±0.14ab 3.63±0.18ab 2.98±0.22ab 3.52±0.25ab F值 145.865 412.540 156.550 134.228 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

生地是治療中風經典方中的常用藥，《中藥學》將其列為“清熱涼血”藥，載其具有“清熱涼血、養陰生津”之效［10］?！渡褶r本草經》《藥性論》等載其有“逐血痹”“通血脈”“活血生新”之效，《本草正義》稱其“非謂地黃滋補之藥，竟能消積通痹也。生者尤良，則采取鮮新，其力尤足耳”。上述文獻中均強調地黃的“生用”，當成為熟地時便不再具有活血生新之效。梓醇遇熱不穩定，生地炮制成熟的過程也正是梓醇含量遞減至基本消失，而糖類遞增的過程［11-12］。基于此，本項目組認為：梓醇作為生地中的標志性成分，有可能是生地發揮“活血生新”功效的主要原因，其中“生新”主要體現在“生新脈”，即“促進血管新生、成熟、微循環重建”等［5］。在腦梗死的臨床治療過程中，缺血區血管重建與血液再灌注是治療的重點。為恢復血液供應，除溶栓、開放血管旁路外，促進微血管網的形成是修復半暗帶神經元和重塑神經功能的另一條重要途徑。血管新生到功能血管網的形成包括細胞外基質降解、內皮細胞芽生、尖端細胞遷移、莖細胞增殖等［13］。VEGF是內皮細胞特異性促有絲分裂原和趨化因子，作用于血管內皮細胞表面的相應受體，從而激活相關的缺血缺氧轉導通路，促進新生血管形成。本研究組前期研究表明，地黃梓醇可以作用于VEGF及其受體，從而發揮促腦微血管生成的作用［5］。Notch信號通路對促進血管新生及神經功能的恢復十分重要［14］。Notch信號通路可由VEGF激活，亦可刺激VEGF的表達，當這種平衡調節被打破后，就會導致無功能的血管生成、血管滲漏或血管生成過度。本研究通過觀察生地梓醇作用于VEGF及其受體后，激活下游Notch信號通路及其受體的變化，探討VEGF與Notch信號通路之間的互相調控作用，VEGF是Notch信號通路的正向調控基因，而Notch信號通路對VEGF具有負反饋調控作用，從而誘導新生血管進化為功能成熟和管腔完整的成熟血管，最終形成具有完整功能的血管網［15-16］。腦血管網絡的重建和再通與神經結構網絡的重構在結構和功能上相偶聯，微血管新生與血管網絡重建是實現腦缺血后神經功能重塑的關鍵。

本研究結果顯示，生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后1、5、8 d神經功能評分、平衡木實驗評分高于假手術組，生地梓醇組大鼠造模后5、8 d神經功能評分、平衡木實驗評分低于生理鹽水組；生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后5、8 d神經功能評分、平衡木實驗評分分別低于本組造模后1 d，生理鹽水組、生地梓醇組大鼠造模后8 d神經功能評分、平衡木實驗評分分別低于本組造模后5 d；從行為學層面體現了生地梓醇的神經功能重塑作用。TTC染色結果顯示，假手術組大鼠無腦梗死現象；生理鹽水組大鼠仍有腦梗死現象；生地梓醇組大鼠仍存在腦梗死現象，但梗死范圍較生理鹽水組減小，腦組織缺血再灌注恢復及組織形成情況明顯優于生理鹽水組；從組織形態學層面體現了生地梓醇改善缺血區再灌注與腦組織保護作用。本研究結果還顯示，生地梓醇組大鼠腦組織VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4 mRNA相對表達量高于假手術組、生理鹽水組，表明生地梓醇可上調VEGF、VEGFR、Notch1、Notch4表達，激活Notch信號通路，調控血管新生與成熟，促進功能血管生成，進而實現神經功能重塑。有研究表明，生地梓醇通過上調VEGF來發揮促血管新生作用的同時，伴有組織水腫的加重［17］。而本研究發現生地梓醇能夠實現VEGF/Notch信號通路的雙調控，形成功能穩定的血管網，且并未發現大鼠腦組織水腫加重。因此，VEGF與Notch信號通路的動態平衡是微血管形成和穩定的關鍵。

本實驗大鼠樣本量較小，結果可能存在偏倚，仍需要大樣本量的研究進一步證實。對于生地梓醇在臨床中的促血管新生與神經重塑作用，有待于進一步探討。

綜上所述，生地梓醇可通過調控VEGF及VEGFR激活Notch信號通路來促進血管新生與神經功能重塑，且不增加組織水腫。其促血管新生作用可視為生地“生新脈”功效的微觀體現，值得進一步研究及臨床轉化。

作者貢獻：孫立平、周霞進行文章的構思與設計；劉炬、劉偉進行研究的實施與可行性分析；郭炳杉進行數據收集、整理；王祥煜進行統計學處理；孫立平、張佳樂進行結果的分析與解釋；孫立平撰寫論文；周霞進行論文的修訂，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。