中藥貼膜對兔膝骨性關節炎關節軟骨下骨BMP-2蛋白表達的影響

徐英杰，尹羽薇，趙海燕*，付新，董清平，孫羽佳，張宇馳

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

骨性關節炎(Osteoarthritis，OA)是一種以關節軟骨退行性變和繼發性骨質增生為主要病理特征的慢性骨關節疾病，本病沒有明顯的種族和地域差異，在超過50歲以上人群中，僅次于心血管疾病排名第二[1]。本病是老年人膝關節疼痛、活動不便的主要原因之一，隨著社會老齡化進程不斷加劇，本病的發病率及發病絕對人數與日俱增[2]。在前期實驗證實中藥貼膜能夠有效治療膝關節骨性關節炎的基礎上[3]，本實驗應用免疫組化和Western blot兩種方法，檢測運用不同方法治療兔膝骨性關節炎模型后關節軟骨下骨BMP-2含量表達的變化，以期進一步揭示中藥貼膜干預膝骨性關節炎關節退變的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年新西蘭兔50只，3～4月齡，體質量2.5～3 kg，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK黑2015-003。

1.2 實驗藥物

中藥貼膜主要成分為元胡、川芎、骨碎補、續斷、冰片等，由黑龍江中醫藥大學實驗實訓中心在原中藥超微粉[4]基礎上制備而成。玻璃酸鈉注射液：上海景峰制藥股份有限公司生產(國藥準字 H20000643)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備

將白兔普通飼養1周以適應環境，并經過一般觀察無異常后，采用Hulht法，建立兔右膝關節骨性關節炎模型[5]。

1.3.2 動物分組及給藥方法

將造模成功的實驗動物隨機分為中藥貼膜組、玻璃酸鈉組、傳統中藥組、模型對照組，每組10只，另取10只健康白兔作為空白對照組。按照分組采用如下方法治療：①空白對照組給予正常飼養不做治療；②中藥貼膜組給予中藥貼膜外敷治療，1次/日，12 h/次，共治療6周；③玻璃酸鈉組于術后1周開始行右膝關節腔內玻璃酸鈉注射治療，劑量為0.25 mL/次，1次/周，連續治療5周；④傳統中藥組采用普通粉碎方法粉碎中藥(藥物組成與中藥貼膜組相同)加入促透劑外敷治療，1次/日，12 h/次，共治療6周；⑤模型組給予醫用橡皮膏外敷治療，1次/日，12 h/次，共治療6周。

1.3.3 免疫組化觀察關節軟骨下骨中 BMP-2含量

治療結束后，所有動物采用空氣栓塞法處死，無菌條件下取股骨內側切口打開膝關節腔，切取右膝關節上下各1cm 厚軟骨下骨質的標本。采用免疫組織化學法觀察各組標本關節軟骨下骨中BMP-2，具體操作步驟如下：①石蠟切片常規脫水，二甲苯脫蠟，酒精梯度水化；②3% H2O2去離子水孵育5～10 min；③PBS 2 min內3次沖洗；④滴加一抗，37 ℃孵育1～2 h，PBS 2 min內3次沖洗；⑤按照一抗的來源，分別滴加BMP-2血清單克隆抗體，37 ℃孵育30 min，PBS 2 min內3次沖洗；⑥DAB染色，蒸餾水充分沖洗；⑦酒精脫水,二甲苯透明，封片劑封片。

1.3.4 Western blot測定關節軟骨下骨中 BMP-2含量表達

將各組實驗動物右膝關節軟骨下骨組織取出后迅速放入液氮中冷凍，按以下步驟操作：

①提取組織總蛋白:解凍標本，放入研缽，將其研碎。將研碎的骨組織放入勻漿器中，按照每20 mg組織加入100 μL RIPA裂解液。RIPA裂解液在使用前數分鐘內加入PMSF，使其終濃度為1 mmol/L。在冰上勻漿，直至充分裂解。充分裂解后，4 ℃，14 000 r/min離心5 min，取上清保存于-70 ℃冰箱中。②蛋白質的定量:加2 μL超純水于超微量紫外分光光度儀上，進行調零。擦去超純水，加提取的蛋白質樣品取2 μL，測出蛋白質濃度。③蛋白質電泳:配置10%分離膠。沿玻片用吸管加入模具中，等待凝膠聚合。加濃縮膠于分離膠之上，待濃縮膠聚合約30 min后，放置在電泳槽內，加入電泳液。按照4∶1比例(加樣緩沖液)混合樣品，在100 ℃條件下加熱約10 min，短暫離心。連接電源，100 V約90 min，至溴酚蘭到達分離膠底部。卸下玻板，小心撬開玻板，取出凝膠。④轉印:浸潤PVDF膜，切比PVDF膜略小的濾紙40張，潤濕濾紙，移開轉移裝置安全蓋和陰極，按順序鋪潤濕濾紙20張，鋪PVDF膜，鋪凝膠，鋪潤濕濾紙20張，放置好陰極，安裝轉印裝置，連好連接線，打開電源，25 V轉印2.5～3 h，轉膜后小心取出PVDF膜。⑤免疫檢測:在放有轉印后PVDF膜的表面皿中加封閉液，液面必須過膜，搖床上輕搖60 min，棄去封閉液，TBST洗膜3次，每次5 min，棄去TBST，搖床上溫和搖動2 h后，4 ℃過夜，棄去一抗，TBST洗3次，每次5 min，棄去TBST，將膜放入一個可封口的塑料袋中加二抗，搖床上溫和搖動4 h，棄去二抗，TBST洗3次，共30 min，按照DAB顯色試劑盒說明配置好顯色液，將PVDF膜放入顯色液中顯色，待條帶顯色清晰后用蒸餾水終止反應。

1.3.5 統計學處理方法

免疫組化結果參照前期實驗所用的形態計量學研究方法研究[6]，BMP-2的表達量用細胞分數表示。蛋白印跡結果用凝膠成像分析系統取圖，并分析密度，結果以目標條帶的密度與內參條帶的密度之比表示。

2 實驗結果

2.1 免疫組化測定兔膝關節軟骨下骨BMP-2表達結果

表1 免疫組化測定兔膝關節軟骨下骨BMP-2表達結果

結果顯示，空白對照組膝關節軟骨下骨中BMP-2表達較高，模型組膝關節軟骨下骨中BMP-2表達明顯減低，與空白對照組性比較，P<0.01。玻璃酸鈉組BMP-2表達較模型組高(P<0.01)，但低于傳統中藥組和中藥貼膜組(P<0.01)。中藥貼膜組BMP-2表達量在各治療組中相對最高，與空白對照組接近。

2.2 Western blot測定兔膝關節軟骨下骨BMP-2蛋白表達結果

表2 Western blot測定兔膝關節軟骨下骨BMP-2蛋白表達結果

檢測結果顯示，空白對照組BMP-2蛋白表達量在各組中最高，模型組BMP-2蛋白表達量較空白對照組明顯降低(P<0.01)，為空白對照組的0.29倍，玻璃酸組BMP-2蛋白表達量為空白對照組的0.42倍，較模型組增高(P<0.01)。傳統中藥組及中藥貼膜組BMP-2蛋白表達量均較玻璃酸鈉組高(P<0.05)。

3 討論

中藥貼膜由骨碎補、續斷、元胡、川芎、冰片等各等分組成。方中以骨碎補為君，活血續傷，補腎強骨，《開寶本草》謂其“主破血止血，補傷折”。續斷補腎強筋，療傷續折為臣藥，以助骨碎補補腎續傷之力。《本草匯言》曰：“續斷，補續血脈之藥也。大抵所斷之血脈非此不續；所傷之筋骨非此不養；所滯之關節非此不利”。元胡活血，行氣，止痛?！侗静菥V目》言元胡“能行血中氣滯，氣中血滯，故專治一身上下諸痛”；川芎活血行氣，祛風止痛。《本草匯言》曰:“川芎味辛性陽，氣善走竄而無陰凝粘滯之態，隨入血分，有能去一切風，調一切氣之功”；冰片開竅通絡，《醫林纂要》曰“能透骨熱”，“亦能生肌止痛”。以上3味共為佐藥。方中諸藥合用，共奏補腎通絡，續筋強骨，祛風活血之功。

現代研究證實延胡索提取物中延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素都有明顯的止痛作用[7]；川芎提取物中川芎嗪可促進骨折患者的骨折愈合和血腫的吸收[8]；骨碎補提取物中主要成分柚皮苷在骨性關節炎動物模型治療過程中，具有抑制關節軟骨細胞凋亡作用[9]；續斷皂苷為續斷提取物，其中含有使骨損傷愈合作用的活性組分，具有促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的作用，從而起到增強骨痂形成，改善骨小梁局部微觀結構，促進骨形成的作用[10]；冰片為近乎純粹的右旋龍腦具有良好的抗炎和透皮吸收作用[11]。

關節軟骨和軟骨下骨在骨性關節炎病變過程中存在既相互獨立，又相互作用的關系。治療骨性關節炎時即要注重關節軟骨退變，同時也應該預防軟骨下骨的發病，調節關節軟骨與軟骨下骨的相互生物力學作用機制，糾正關節軟骨的整體生物化學環境和代謝條件。RADIN等[12]認為，軟骨下骨異常在骨性關節炎發病機制中的引發重要作用，較薄的關節軟骨層使其不能再分散下肢所受的應力，能量的沖擊負荷應力致使軟骨下骨骨小梁發生微骨折。這些骨折的修復繼而會導致骨硬度的增加，致使關節局部吸收肢體傳導沖擊能力的減弱，關節軟骨表面暴露的應力增大。FLOREA等[13]通過建立兔骨性關節炎模型并通過CT評估造模成功后膝關節軟骨下骨結構改變，發現骨性關節炎動物模型軟骨下骨變薄，骨小梁數量減少，蛋白聚合含量降低。

目前軟骨下骨與骨性關節炎的微觀結構變化的詳細發病機制雖然還沒有完全明確，但因為軟骨下骨與關節軟骨之間的密切解剖關系，決定了關節的軟骨下骨在骨性關節炎發病過程中起重要作用。研究顯示發生骨性關節炎病理改變時，軟骨下骨處于高轉化狀態、局部代謝加強、局部骨質疏松形成，極易發生軟骨下骨微損傷，且微損傷的修復作用降低，關節異常負荷使軟骨下骨發生形變以緩沖所增加的應力，同時亦導致骨小梁微細骨折。反復微損傷啟動骨重塑過程加快，最終導致的軟骨下骨增厚和密度增高，軟骨下骨質變硬，使軟骨和軟骨下骨硬度差增大，此時局部外力作用異常會使關節軟骨所受的應力作用變大，導致關節軟骨退變[14]。因此，調節關節軟骨下骨的代謝速度，改善軟骨下骨的病變，應納為治療骨性關節炎的重要目標，并可能成為治療骨性關節炎的新的途徑。

本實驗結果顯示，模型組兔膝關節軟骨下骨中BMP-2蛋白表達含量明顯降低，成為早期骨性關節炎軟骨下骨生成能力下降的原因，軟骨下骨新骨生成能力下降導致早期骨性關節炎軟骨下骨的局限性骨質疏松，增大了關節軟骨的負荷應力，從而加重了關節軟骨的退變。各治療組經過治療后，都在提高關節軟骨下骨BMP-2蛋白表達起到了一定的作用，其中臨床常用的玻璃酸鈉對關節軟骨下骨BMP-2生成能力雖有一定的提高，但低于傳統中藥組和中藥貼膜組，表明我們所采用的中藥組方在促進軟骨下骨新骨生成能力優于玻璃酸鈉。中藥貼膜組促進BMP-2能力較傳統中藥組強，證實應用提取的中藥成分制備成貼膜后，可以對骨性關節炎軟骨下骨退變干預作用起到更好的效果。因此，中藥貼膜在早期骨性關節炎治療過程中，對提高關節軟骨下骨BMP-2表達起到良好的干預作用，在避免早期骨性關節炎關節軟骨下骨退變起到積極作用，繼而從另一方面達到對關節軟骨的保護作用。