黨參水提物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠肺組織自噬蛋白BNIP3表達(dá)的影響

康甲超，蒙潔，陳冬梅，王勇，吳萍民，王晶

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

衰老是人體必經(jīng)的一個(gè)自然過(guò)程，其不僅在組織器官，而且在細(xì)胞水平也可引起機(jī)體功能的變化，大量研究表明衰老與細(xì)胞自噬密切相關(guān)[1-2]。細(xì)胞自噬是機(jī)體為了適應(yīng)不同環(huán)境而做出的有效內(nèi)部調(diào)節(jié)，適度的自噬可以有效延緩衰老、改善衰老相關(guān)疾病[3]；然而，自噬是一個(gè)降解過(guò)程，過(guò)度的自噬對(duì)機(jī)體有害，任何過(guò)度的自噬都可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4-5]。黨參Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.具有益氣補(bǔ)中，延緩衰老的功效[6]，并且有研究發(fā)現(xiàn)黨參可以抑制腦組織細(xì)胞自噬水平以減輕腦缺血再灌注損傷[7]。前期課題組研究發(fā)現(xiàn)黨參對(duì)衰老肺組織具有保護(hù)作用，研究中通過(guò)對(duì)各組肺組織基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)基因Bnip3在肺組織衰老后和高劑量黨參干預(yù)后均發(fā)生差異改變[8]。BNIP3是一種僅有BH3的自噬蛋白，既能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，又能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[9]。為了進(jìn)一步了解自噬蛋白BNIP3對(duì)衰老肺組織的作用以及黨參的干預(yù)功效，本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖復(fù)制小鼠衰老模型，通過(guò)檢測(cè)各組小鼠肺組織中自噬蛋白BNIP3和基因Bnip3的表達(dá)量，以期發(fā)現(xiàn)黨參對(duì)衰老肺組織在自噬方面的保護(hù)機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠100只，雌雄各半，2月齡，體質(zhì)量(18±2)g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(甘)2015-0002。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，室溫20～25 ℃，自然光照，攝食和自由飲水。所有實(shí)驗(yàn)程序和方案均按照甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)(編號(hào)：2017-106)的指導(dǎo)方針執(zhí)行。

1.2 藥物

黨參，采自甘肅岷縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室杜弢教授鑒定為白條黨參。取黨參100 g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加6倍量水煎煮1 h，合并2次提取液，過(guò)濾，濃縮成含原藥材0.5 g/mL的水煎劑，置4 ℃冰箱保存，黨參水提物每5 d制備1次。

1.3 主要試劑

D-半乳糖購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：24895207，臨用前用生理鹽水配制成12 g/L備用；引物均由Invitrogen公司提供；Trizol試劑購(gòu)于Invitrogen公司，貨號(hào)15596-026；SYBR熒光染液購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，貨號(hào)4367659；快速定量RT試劑盒購(gòu)于中國(guó)天根生化科技有限公司，貨號(hào)KR106-02；兔抗BNIP3抗體(1∶150)購(gòu)于中國(guó)索萊寶公司，貨號(hào)K004134p；兔SP試劑盒(兔鏈霉卵白素-生物素法檢測(cè)系統(tǒng))購(gòu)于中杉金橋，貨號(hào)SP9001-6；DAB顯色試劑盒購(gòu)于中杉金橋，貨號(hào)ZL1-9018-3。

1.4 主要儀器

透射電子顯微鏡JEM-1230，購(gòu)于日本捷歐路科貿(mào)有限公司；離心機(jī)5415D，購(gòu)于德國(guó)艾本德公司；PCR7500系統(tǒng)，購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；凝膠成像系統(tǒng)UVP I-D001，購(gòu)于博奧生物集團(tuán)有限公司；光學(xué)顯微鏡，購(gòu)于日本奧林巴斯公司。

2 方法

2.1 分組

將100只SPF級(jí)昆明種小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和黨參低、中、高劑量組，每組20只，雌雄各半。

2.2 造模及給藥

依照龔國(guó)清等人的造模方法造模[10]，采用頸背部皮下注射D-半乳糖溶液復(fù)制衰老模型，給藥劑量為每日每只小鼠50 g/L D-半乳糖溶液，注射量為0.025 mL/g。造模的同時(shí)黨參低、中、高劑量組給予5、10、15 g/kg黨參溶液灌胃，灌胃體積為每日每只小鼠0.025 mL/g，正常對(duì)照組和衰老模型組給予等量生理鹽水灌胃，以上造模連續(xù)42 d。

2.3 透射電子顯微鏡

于末次給藥2 h后，用10%水合氯醛麻醉動(dòng)物，頸椎脫臼法處死小鼠，分別將取得的正常對(duì)照組、模型組和黨參低、中、高劑量組小鼠肺組織沖洗干燥后切成約1～3 mm/片，然后將其放入預(yù)先冷卻的2.5%戊二醛溶液中，在4 ℃下固定過(guò)夜，用PBS沖洗3次，1%鋨酸染色，脫水，浸泡，包埋，聚合后將肺切成70 nm片狀，重新染色后觀(guān)察正常對(duì)照組、模型組和高劑量黨參組肺組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。

2.4 RT-PCR方法

采用Trizol試劑提取正常對(duì)照組、模型組和高劑量黨參組總RNA，mRNA定量檢測(cè)采用SYBR熒光染料法進(jìn)行。采用兩端不同的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，經(jīng)逆轉(zhuǎn)后cDNA模板在上下游引物引發(fā)下進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，mRNA表達(dá)量均以GAPDH為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)采用2-△△CT方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR檢測(cè)Bnip3引物序列

2.5 免疫組織化學(xué)染色

于末次給藥2 h后，用10%水合氯醛麻醉動(dòng)物，注射量為0.004 mL/g，頸椎脫臼法處死小鼠，分別將取得的正常對(duì)照組、模型組和黨參低、中、高劑量組小鼠肺組織固定，制作成蠟塊。二甲苯脫蠟12～15 min，3%的過(guò)氧化氫浸泡10 min除去內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，封閉血清后滴加一抗、二抗、顯色劑。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 肺組織超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察

正常對(duì)照組Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)正常；模型組中大量線(xiàn)粒體腫脹，膜結(jié)構(gòu)消失，線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)破壞，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中的板層小體完全脫落；高劑量黨參組中未見(jiàn)異常改變，肺泡腔、板層小體和線(xiàn)粒體無(wú)明顯改變(見(jiàn)圖1)。

3.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

設(shè)計(jì)兩種不同引物檢測(cè)肺組織中基因Bnip3表達(dá)量，使用引物一檢測(cè)Bnip3相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，Bnip3在衰老后肺組織中表達(dá)上調(diào)，在高劑量黨參干預(yù)后表達(dá)下調(diào)(見(jiàn)表2、圖2A)，使用引物二檢測(cè)Bnip3相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，Bnip3在衰老后肺組織中表達(dá)上調(diào)，在高劑量黨參干預(yù)后表達(dá)下調(diào)(見(jiàn)表2、圖2B)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3.3 免疫組織化學(xué)染色

圖像分析采用Image J軟件，分析各組小鼠肺組織免疫組織化學(xué)染色在高倍鏡下三個(gè)視野的BNIP3陽(yáng)性率，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，與正常對(duì)照組相比，模型組BNIP3陽(yáng)性率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，高劑量黨參組BNIP3陽(yáng)性率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表3)。正常對(duì)照組中陽(yáng)性細(xì)胞少見(jiàn)，低劑量黨參組陽(yáng)性細(xì)胞多見(jiàn)，中劑量黨參組中陽(yáng)性細(xì)胞少量，高劑量黨參組中陽(yáng)性細(xì)胞少見(jiàn)，模型組陽(yáng)性細(xì)胞多見(jiàn)，陽(yáng)性率最高，染色結(jié)果最深(見(jiàn)圖3)。

注：圖中△所指為板層小體，→所指為腫脹破壞的線(xiàn)粒體。圖1 肺組織透射電鏡觀(guān)察

表2 RT-PCR不同引物序列檢測(cè)Bnip3相對(duì)表達(dá)量

注：A,Bnip3表達(dá)量(引物一);B,Bnip3表達(dá)量(引物二);與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較,##P<0.01。圖2 RT-PCR方法檢測(cè)衰老后及高劑量黨參干預(yù)后肺組織中Bnip3相對(duì)表達(dá)量

注：圖中→所指為陽(yáng)性細(xì)胞。圖3 各組小鼠肺組織免疫組化結(jié)果(×400)

表3 黨參水提物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠肺組織中蛋白BNIP3表達(dá)的影響

4 討論

細(xì)胞自噬是一把雙刃劍，研究顯示，肺組織細(xì)胞的過(guò)低自噬和過(guò)度自噬均可引起或加重肺損傷[11]。在本次研究中，模型組肺組織超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯異常改變，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞膜受損，大量胞質(zhì)外流，線(xiàn)粒體腫脹破壞；高劑量黨參干預(yù)后肺組織超微結(jié)構(gòu)好轉(zhuǎn)，未見(jiàn)明顯異常。BNIP3定位于線(xiàn)粒體外膜，在細(xì)胞缺氧環(huán)境下其表達(dá)量明顯增多[12]，對(duì)凋亡和線(xiàn)粒體自噬至關(guān)重要[13]。BNIP3在細(xì)胞死亡和存活中的作用已被廣泛研究[14]，誘導(dǎo)BNIP3過(guò)表達(dá)可通過(guò)線(xiàn)粒體功能障礙促進(jìn)大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型的死亡[15]，2005年Lemasters[16]首次提出線(xiàn)粒體自噬的概念，主要指在氧化應(yīng)激、衰老及能量限制等刺激下，細(xì)胞內(nèi)的線(xiàn)粒體發(fā)生去極化損傷使線(xiàn)粒體被破壞。通過(guò)對(duì)模型組和高劑量黨參組超微結(jié)構(gòu)的觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)黨參具有保護(hù)衰老肺組織和肺細(xì)胞中線(xiàn)粒體的作用，其機(jī)制可能與黨參阻止細(xì)胞過(guò)度自噬有關(guān)。

研究表明BNIP3基因敲除導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少，而B(niǎo)NIP3基因過(guò)度表達(dá)則增加了凋亡細(xì)胞的數(shù)量[17]。本研究通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)小鼠衰老后和高劑量黨參干預(yù)后肺組織中Bnip3表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)衰老后肺組織中Bnip3表達(dá)量明顯升高，高劑量黨參干預(yù)后明顯降低；通過(guò)免疫化學(xué)染色技術(shù)，觀(guān)察各組肺組織中BNIP3陽(yáng)性率的變化，模型組中BNIP3陽(yáng)性率最高，高劑量黨參組中BNIP3陽(yáng)性率明顯下降，與RT-PCR結(jié)果一致，再次證明黨參能降低衰老肺組織中BNIP3的表達(dá)量，保護(hù)衰老肺細(xì)胞因BNIP3基因過(guò)度表達(dá)免受凋亡。

綜上所述，黨參能改善衰老小鼠肺組織的超微結(jié)構(gòu)，保護(hù)肺細(xì)胞中線(xiàn)粒體免受破壞，黨參對(duì)衰老小鼠肺組織的保護(hù)作用可能是通過(guò)降低BNIP3的過(guò)度表達(dá)有關(guān)。本研究為黨參對(duì)細(xì)胞自噬影響的藥用開(kāi)發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。