慶大霉素普魯卡因維B12顆粒中維生素B12含量及含量均勻度研究

陳褚建

（浙江省湖州市食品藥品檢驗研究院，浙江 湖州 313000）

慶大霉素普魯卡因維B12顆粒為復方制劑，具有消炎、止痛、促進胃黏膜修復等作用，主要用于治療慢性、淺表性胃炎，其組分為硫酸慶大霉素、鹽酸普魯卡因和維生素B12，其中維生素B12為形成消化道正常上皮細胞的必需物質。該產品現行質量標準［1］中缺少針對維生素B12的檢測控制。本研究中參考2020 年版《中國藥典（四部）》［2］含量均勻度檢查法項下方法及文獻［3－16］，建立高效液相色譜法測定慶大霉素普魯卡因維B12顆粒中維生素B12的含量及含量均勻度，以進一步完善該制劑的質量標準。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；XS205 Dual Range 型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；KQ－500DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

維生素B12對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100248－201705，含量為90.5%）；慶大霉素普魯卡因維B12顆粒（企業A，批號分別為20190649、20190823，20190838）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

1.維生素B12A.對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Vitamin B12A.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

色譜柱：Alltima C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.02 mol／L 磷酸二氫鈉－甲醇（80∶20，V／V）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：361 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：50 μL。

2.2 溶液制備

取維生素B12對照品27.56 mg，置250 mL 容量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，即得對照品貯備液；精密量取1 mL，置100 mL 容量瓶中，加流動相定容，搖勻，即得對照品溶液。取樣品5 袋，研細，精密稱取適量（相當于維生素B120.02 mg），置100 mL 容量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，即得供試品溶液。按慶大霉素普魯卡因維B12顆粒處方和工藝，制備缺維生素B12的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取2.2 項下3 種溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。陰性對照品溶液色譜中，在與維生素B12對照品溶液色譜相應保留時間處無干擾峰，表明專屬性好。詳見圖1。

線性關系考察：精密量取對照品溶液0.1，0.5，1.0，1.5，3.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加流動相定容，搖勻，制成系列對照品溶液，精密量取10 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以維生素B12質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝231.887X－0.128，r＝0.999 9（n＝5）。結果表明，維生素B12質量濃度在0.01～0.30 μg／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密量取2.2 項下對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果維生素B12峰面積的RSD為0.10%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，10，12 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果維生素B12峰面積的RSD為0.64%（n＝7），表明供試品溶液在室溫放置12 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為20190649）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果維生素B12平均含量為標示量的99.7%，RSD為0.53%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量樣品（批號為20190649）適量，精密稱定，共6 份，精密加入維生素B12對照品貯備液0.1 mL，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 維生素B12 加樣回收試驗結果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery test of vitamin B12（n＝6）

2.4 樣品含量及含量均勻度測定

含量測定：取3 批樣品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果3 批樣品中維生素B12的含量分別為標示量的99.82%，98.93%，100.22%（n＝3）。

含量均勻度測定：取3 批樣品，每批10 袋，分別置100 mL 容量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算樣品含量，并計算A＋2.2S的值。結果見表2。

表2 維生素B12含量均勻度計算結果（n＝10）Tab.2 Results of the content uniformity of vitamin B12（n＝10）

3 討論

3.1 檢測波長選擇

預試驗中，取對照品溶液，200～400 nm 波長范圍內掃描，結果維生素B12在361 nm和278 nm 波長處均有最大吸收，考慮到檢測靈敏度及制劑中其他組分的干擾，最終選擇361 nm 作檢測波長。

3.2 流動相選擇

預試驗中比較了0.5%三乙胺溶液－乙腈、水（用10%稀磷酸調pH 為4.5）－乙腈、0.05 mol／L 磷酸二氫銨溶液（磷酸調pH至3.0）－乙腈、0.02 mol／L 磷酸二氫鈉－甲醇等多組流動相系統，結果以0.02 mol／L 磷酸二氫鈉－甲醇（80∶20，V／V）為流動相時，維生素B12色譜峰對稱性好，并與制劑中其他組分達到基線分離。

3.3 方法評價

2020 年版《中國藥典（四部）》中規定，每1 個單劑標示量小于25 mg 的片劑、硬膠囊劑、顆粒劑或散劑等，均應檢查含量均勻度，慶大霉素普魯卡因維B12顆粒中維生素B12標示量為0.02 mg，應建立該成分的含量均勻度檢查項目。本研究結果顯示，3 批制劑的含量均勻度均符合要求。

所建立的方法簡便、準確，專屬性強，重復性好，可用于測定慶大霉素普魯卡因維B12顆粒中維生素B12的含量及含量均勻度。