流式淋巴細胞亞群檢測在癌癥中的臨床應用價值及意義

摘要：目的：研究腫瘤患者外周血中淋巴細胞亞群的各項指標和腫瘤患者臨床信息及預后的相關性。方法：選取肺癌、宮頸癌和乳腺癌患者共134例，收集腫瘤患者外周血并用流式細胞術檢測和分析外周血中淋巴細胞亞群7項指標，同時收集腫瘤患者的臨床信息，分析兩者是否具有相關性。結果：研究發現肺癌及宮頸癌患者外周血中淋巴細胞亞群7項指標，其中CD8陽性T細胞絕對數及CD4/CD8比值同患者的臨床分期、淋巴結轉移和遠處轉移相關。結論：本研究發現肺癌和宮頸癌早中期患者外周血中CD8陽性T細胞的數量較晚期患者明顯增多，提示腫瘤患者外周血中CD8陽性T細胞的數量同患者的預后相關。

關鍵詞：淋巴細胞亞群，流式細胞術，細胞毒性T細胞

【中圖分類號】R4 ? ? ? ? ? ? 【文獻標識碼】A ? ? ? ? ? ? 【文章編號】2107-2306（2021）09--04

由于全球人口的增長和老齡化，以及吸煙、不良飲食和久坐等生活方式導致癌癥患者數量越來越多，全球癌癥負擔持續增加[1]。腫瘤免疫學研究表明，癌癥的發生、發展與機體的免疫狀態密切相關[2， 3]。其中T淋巴細胞是細胞免疫的主要應答形式，在機體抗腫瘤免疫中起主導作用，能夠識別和清除腫瘤細胞[4， 5]。流式淋巴細胞亞群作為一種常規檢查，是反映細胞免疫功能的重要指標，在腫瘤免疫監測具有重要意義，進一步為患者的臨床治療方案提供參考依據[6， 7]。本研究通過分析患者外周血中CD3陽性T淋巴細胞，CD4陽性T淋巴細胞，CD8陽性T淋巴細胞，B淋巴細胞和NK細胞占淋巴細胞的比例及絕對數，并將這些指標相結合，從而評估機體的免疫功能狀態。

1.材料與方法

1.1材料

采集天津市腫瘤醫院空港醫院放療科住院患者EDTA抗凝外周血2ml。所有患者采血前均未接受過腫瘤治療，并且具有完整的臨床相關資料。

1.2實驗方法

取100ul外周血樣本加入流式管中，標記CD3/CD19/CD16+CD56/CD45和CD3/CD4/CD8/CD45抗體（Beckman Coulter公司），室溫孵育15分鐘，加入500ul溶血素（Beckman Coulter公司），室溫靜置10分鐘，PBS洗滌細胞后上機。流式數據用Kaluza軟件（Beckman Coulter公司）進行分析。

1.3統計學方法

應用SPSS statistics 21軟件進行統計學分析。當樣本數據符合正態分布時，獨立樣本之間采用t檢驗或者單因素分析檢驗的統計學方法;當樣本數據不符合正態分布時，樣本之間采用非參數t檢驗和Kruskal-Wallis檢驗的統計學方法。P<0.05為差異具有統計學意義。

2.結果

2.1外周血中淋巴細胞亞群同預后相關

本研究中共收集肺癌32例，乳腺癌59例，宮頸癌43例。其中乳腺癌均為確定將接受手術患者，而肺癌和宮頸癌都未接受手術治療。因此從癌種和治療方式進行評估，乳腺癌較肺癌和宮頸癌具有更好的預后。本研究共收集患者外周血中CD3陽性T細胞、CD4陽性T細胞和CD8陽性T細胞占淋巴細胞百分比和絕對值6項指標，加上CD4/CD8比值共7項指標進行數據分析，結果如圖1所示。三個癌種間，CD3陽性T細胞和CD4陽性T細胞的絕對數都相近，無統計學差異（圖1A和圖1B）;但是肺癌和宮頸癌患者外周血中CD8陽性T細胞的絕對數明顯較乳腺癌患者降低（圖1C，P值分別為0.0080**和0.0003***）。而當分析三種淋巴細胞亞群在外周血中占淋巴細胞百分比時，我們發現CD4陽性T細胞占淋巴細胞百分比在三個癌種之間無差異（圖1E），而乳腺癌患者外周血中CD3陽性T細胞和CD8陽性T細胞占淋巴細胞百分比高于肺癌和宮頸癌患者（圖1D和1F）。由于肺癌和宮頸癌較乳腺癌是更為開放性腫瘤，因此其他淋巴細胞比如NK細胞數量較乳腺癌會增加，這就導致CD3陽性T細胞比例在乳腺癌中會升高，但是CD3陽性T細胞絕對數并沒有差異，這也從側面反應了淋巴細胞亞群的絕對數較其占淋巴細胞百分比是更好的參考指標。此外乳腺癌患者CD8陽性T細胞占淋巴細胞百分比較肺癌和宮頸癌患者高，也再次證實了乳腺癌患者具有更多數量的CD8陽性T細胞。更為直觀的CD4/CD8比值指標顯示，乳腺癌患者的CD4/CD8比值低于肺癌和宮頸癌患者（圖1G）。因此我們認為在預后較好的乳腺癌患者人群中，其CD8陽性T細胞絕對數明顯高于預后較差的肺癌和宮頸癌患者，同時乳腺癌患者的CD4/CD8比值低于肺癌和宮頸癌患者。

A. 三種癌癥患者外周血中CD3陽性T細胞絕對數的相互比較;B. CD4陽性T細胞絕對數的相互比較;C. CD8陽性T細胞絕對數的相互比較;D. CD3陽性T細胞占淋巴細胞百分比的相互比較;E. CD4陽性T細胞占淋巴細胞百分比的相互比較;F. CD8陽性T細胞占淋巴細胞百分比的相互比較;G. CD4/CD8比值的相互比較

上述結果提示通過檢測癌癥患者外周血樣本的淋巴細胞亞群，CD8陽性T細胞絕對數較高的患者具有更好的預后。此外CD4/CD8比值較低的患者也具有較好的預后，也再次證實這類患者的CD8陽性T細胞數量較多。為了再次驗證我們的結論，本研究分別將肺癌和宮頸癌患者的外周血淋巴細胞亞群的7項指標同患者的臨床信息相結合分析，進行深入的研究探索。

2.2肺癌患者外周血淋巴細胞亞群同其臨床信息的相關性分析

共收集肺癌患者32例，其中男性24例，女性8例，年齡分布37-78歲。其中肺鱗癌8例，肺腺癌9例，其它病理類型的肺癌15例，多為中晚期患者。由于早期患者較少，因此本研究將臨床分期進行N分期和M分期單獨分析。

我們將這7項指標分別與患者的性別，年齡，病理類型，淋巴結轉移和遠處轉移進行分析。結果顯示其中CD3陽性T細胞和CD4陽性T細胞占淋巴細胞百分比和絕對數與患者的所有臨床信息都無統計學差異，沒有相關性。而CD8陽性T細胞絕對數與患者臨床信息相關性如圖2表1所示。其中淋巴結轉移定義為N3的患者其外周血樣本中CD8陽性T細胞絕對數同樣明顯低于N2患者（如圖2C所示）;有遠處轉移的患者其CD8陽性T細胞的絕對數也明顯低于無轉移的患者（圖2A所示）。這部分結果與2.1的結果相一致，我們證實了肺癌早中期患者外周血中CD8陽性T細胞絕對數要明顯高于肺癌晚期患者，提示外周血中CD8陽性T細胞絕對數是預后相關的指標之一，具有較高CD8陽性T細胞的患者可能具有更好的預后。

A. CD8陽性T細胞絕對數同遠傳轉移的相關性;B. CD4/CD8比值同遠傳轉移的相關性;C. CD8陽性T細胞絕對數同淋巴結轉移的相關性;D. CD4/CD8比值同淋巴結轉移的相關性

同時我們也分析肺癌患者外周血中CD8陽性T細胞占淋巴細胞百分比與患者臨床信息的相關性，發現無任何統計學差異。提示對于腫瘤患者外周血中淋巴細胞亞群指標，淋巴細胞及其亞群的絕對數較亞群占淋巴細胞百分比是更為優秀及能夠正確反應患者免疫功能狀態的指標。

與CD8陽性T細胞指標一樣，CD4/CD8也同肺癌患者的淋巴結轉移和遠處轉移具有相關性，具有對側淋巴結及遠處轉移的肺癌患者具有更高的CD4/CD8比值，如圖2B和圖2D及表1所示。

通過上述結果，我們證實了肺癌患者外周血中CD8陽性T細胞的絕對數與患者的腫瘤進展具有相關性，晚期患者其CD8陽性T細胞較少，自身的免疫功能較弱，更有利于腫瘤發生發展及轉移，同時也具有更差的預后。那與CD8陽性T細胞絕對數該指標相關聯的指標CD4/CD8比值也能夠從另一個側面反應肺癌患者的免疫功能狀態，提示預后。兩者相結合從而給臨床一個重要的信息，方便患者的后續治療。

2.3宮頸癌患者外周血淋巴細胞亞群同其臨床信息的相關性分析

為了進一步驗證我們上述的結論，我們再次收集宮頸癌患者43例，年齡分布25-69歲，病理類型都為鱗癌。根據TNM分期，本研究分別將患者外周血中淋巴細胞亞群的指標與患者臨床信息進行分析。

結果顯示其中CD3陽性T細胞和CD4陽性T細胞占淋巴細胞百分比和絕對數與患者的所有臨床信息都無統計學差異，沒有相關性，CD8陽性T細胞占淋巴細胞百分比與患者的臨床信息同樣無統計學差異。宮頸癌患者外周血中淋巴細胞亞群指標CD8陽性T細胞絕對數及CD4/CD8比值則同宮頸癌患者的臨床T分期，淋巴結轉移和遠處轉移相關，如圖3表2所示。有淋巴結轉移和遠處轉移的宮頸癌患者其外周血中CD8陽性T細胞的數量較沒有淋巴結和遠處轉移的患者要少（圖3A和3C），同時CD4/CD8比值明顯升高（圖3B和3D）。根據單因素分析我們發現宮頸癌患者外周血中CD4/CD8比值同T分期具有相關性，但是CD8陽性T細胞的絕對數則和T分期無統計學差異（表2）。進一步分析T1-T4期宮頸癌患者外周血中CD8陽性T細胞絕對數和CD4/CD8比值同T分期的相關性，我們發現T4期宮頸癌患者外周血中CD8陽性T細胞數量要少于T3期（如圖3E所示，有統計學差異）和T1-T2期（如圖3E所示，無統計學意義。猜測由于樣本數量不夠，導致其沒有統計學差異）。而T4期患者的CD4/CD8比值要明顯高于T1-3期患者（如圖3F所示，均有統計學差異）。因此早中期宮頸癌患者較晚期宮頸癌患者外周血中具有更多的CD8陽性T細胞數量和較低的CD4/CD8比值;而有淋巴結和遠處轉移的宮頸癌患者外周血中CD8陽性T細胞數量低于無轉移的宮頸癌患者，CD4/CD8比值則較高。

A. CD8陽性T細胞絕對數同淋巴結轉移的相關性;B. CD4/CD8比值同淋巴結轉移的相關性;C. CD8陽性T細胞絕對數同遠處轉移的相關性;D. CD4/CD8比值同遠處轉移的相關性;E. CD8陽性T細胞絕對數同臨床T分期的相關性;F. CD4/CD8比值同臨床T分期的相關性

這部分結論提示宮頸癌患者外周血中CD8陽性T細胞的絕對數同宮頸癌的腫瘤進展轉移及預后相關，與肺癌患者的完全一致，也再次驗證了我們在2.1部分提出的結論或者假設：腫瘤患者外周血中CD8陽性T細胞的絕對數及其相關聯的指標CD4/CD8比值同腫瘤的發生發展和轉移相關，同時這兩個指標也是腫瘤患者預后的獨立因素。外周血中具有較多數量的CD8陽性T細胞（CD4/CD8比值相對較低）的腫瘤患者具有更好的預后。

3.討論

免疫系統是機體執行免疫應答及免疫功能的重要系統，具有監視、防御和調控的作用[8]。免疫系統不僅能夠識別外來入侵的病原體，同時也能夠識別和清除體內發生突變的腫瘤細胞、衰老細胞等其他有害成分。正常情況下發生突變的腫瘤細胞都會被機體的免疫系統識別并且清除，但是腫瘤患者體內的腫瘤細胞由于腫瘤微環境的復雜性，使其逃脫了機體的免疫監視，進而發生發展甚至轉移。如何使機體有效識別腫瘤細胞并對其進行清除是腫瘤治療的核心問題之一[9-10]。

機體的免疫系統由多種成分構成，包括免疫器官、免疫細胞和免疫分子。淋巴細胞作為主要的免疫細胞，在免疫系統發揮功能的過程中起重要作用[4]。淋巴細胞簡單的我們可以劃分為CD3陽性T細胞，B淋巴細胞和NK細胞，其中CD3陽性T細胞又可以分為CD4陽性T細胞和CD8陽性T細胞。再往下細分我們又可以將CD4陽性T細胞分為輔助性T細胞，記憶型T細胞，調節性T細胞等等[11， 12]。此外巨噬細胞、DC細胞和MDSC細胞也是免疫細胞的重要成員，協助免疫系統發揮功能。腫瘤免疫微環境是一個非常復雜的內環境，不僅包括腫瘤細胞，免疫細胞，內皮細胞等其他細胞，還包括各種細胞因子和基質成分。由于免疫細胞以及腫瘤微環境的復雜性，我們無法做到實時地檢測所有免疫細胞，因此我們通過流式細胞術檢測腫瘤患者外周血中CD3陽性T細胞，CD4陽性T細胞，CD8陽性T細胞，B淋巴細胞和NK細胞來評估腫瘤患者的一個免疫功能狀態，從而為臨床提供有用的信息[13， 14]。

T淋巴細胞介導的細胞免疫是機體主動的免疫應答，T淋巴細胞具有多種生物學功能，如直接殺傷靶細胞、輔助B細胞產生抗體以及產生細胞因子等[15-17]。而CD8陽性T細胞是細胞毒性T細胞，能夠直接殺傷靶細胞[18]。因為本研究檢測和分析T淋巴細胞及其亞群同臨床的相關性。結果顯示腫瘤患者外周血中同細胞毒性T細胞相關的兩個指標CD8陽性T細胞絕對數和CD4/CD8比值同腫瘤患者的臨床信息相關，早中期腫瘤患者外周血中細胞毒性T細胞數量要高于晚期患者，提示細胞毒性T細胞的數量與腫瘤患者的預后相關。腫瘤患者外周血中具有較多數量的細胞毒性T細胞，其具有更好的預后。本研究很好的詮釋了細胞毒性T細胞作為機體免疫系統殺傷腫瘤細胞的主要執行者，只有這類淋巴細胞基數達到一定數量時，機體的免疫系統才有可能去殺傷腫瘤細胞;而如果這類細胞的數量基數都很低，機體的免疫系統就無法去殺傷腫瘤細胞，從而影響后續的治療包括一些免疫單抗治療，如PD-1，CTLA-4等[19]。外周血淋巴細胞亞群雖然不能夠準確反應腫瘤原位中淋巴細胞亞群的狀態，但是外周血樣本取材方便，檢測準確的特點，同時同一患者外周血和腫瘤原位淋巴細胞亞群變化具有一致性，使得外周血淋巴細胞亞群分析成為目前最為可行的評估腫瘤患者免疫狀態[20-22]。

通過本研究，我們發現腫瘤患者外周血中CD8陽性T細胞的絕對數同患者的臨床分期，淋巴結轉移和遠處轉移相關，提示可能是腫瘤患者預后的獨立因素之一。腫瘤患者外周血中CD8陽性T細胞的數量越多，患者具有更好的預后。我們希望通過檢測腫瘤患者外周血中淋巴細胞亞群，為臨床提供有價值的信息，進而使臨床能夠根據每個患者的免疫功能狀態制訂個體化的治療策略，也使每個患者能夠從各項檢測中得到最優化的獲益。

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*本課題受國家自然科學基金項目（81602020）資助

通訊作者：金昊

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