黃瓜葉綠素降解關鍵酶基因CsPAO的克隆與分析

程奕秋，劉偉康，陳廣玲，孫 錦

(南京農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，南京 210095)

葉綠素(chlorophyll, Chl)所進行的光合作用是自然界一切生命的基礎和源泉，對植物生長及農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的形成具有極其重要的作用。葉綠素是自然界最重要的光合色素之一，植物中的葉綠素主要為葉綠素 a 和葉綠素 b，以激發(fā)形式將光子能量轉(zhuǎn)變成化學能。葉綠素降解是衰老葉片與成熟果實中綠色消失的深層原因[1]。許多生物和非生物脅迫均可促進植物葉綠素降解，如高溫[2]、低溫[3]、強光[4]以及黑暗[5]都可能引發(fā)葉綠素的降解。葉綠素降解包括葉綠素的氧化降解和酶降解兩個方面[6]。其中，氧化降解與活性氧的產(chǎn)生和猝滅有關，酶降解途徑目前比較認可的是PAO途徑，而脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶(pheophytin pheophorbide hydrolase，PPH)和脫鎂葉綠酸 a 加氧酶(pheophorbide a oxygenase，PAO)是葉綠素降解代謝的關鍵酶[7-9]。

脫鎂葉綠酸氧化酸基因(CsPAO)編碼位于葉綠體的內(nèi)囊體膜上的非亞鐵單加氧酶，該酶具有高度的底物特異性，能專一地催化脫鎂葉綠酸 a氧化生成紅色葉綠素代謝產(chǎn)物(red chlorophylcatabo-lite，RCC)。目前，已在玉米、擬南芥、油菜、番茄、大豆、水稻、小麥、杧果等多種植物[10-15]中克隆出PAO基因。PAO基因是保守基因，存在一個 Rieske 型 (Rieske-type) 結(jié)構域與一個單核鐵結(jié)合(cmononucleariron-binding) 結(jié)構域，它們在N-末端含有保守的葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列，在C-末端含有跨膜結(jié)構域。PAO基因在玉米中為致死葉斑點基因 (ethal leaf spot 1,Lls1)[13]，在擬南芥中為加快細胞死亡基因 (celerated celldeath 1, Acd7)[14]，而油菜中存在2個PAO基因分別為BnPAO1和BnPAO2，BnPAO1只有在種子發(fā)育的早期能夠被檢測，而BnPAO2則整個發(fā)育的過程中都能被檢測到[15]。由此可見，PAO基因在不同的植物里作用方式不同。PAO缺失突變體和反義表達，都出現(xiàn)未成熟細胞壞死現(xiàn)象，在這些株系中，有高濃度的脫鎂葉綠酸a堆積，而植物脫鎂葉綠酸a具有光毒性，在光照下會導致細胞凋亡[16]。

黃瓜(CucumissativusL.)是一種世界性的重要蔬菜作物，也是設施栽培中的主栽蔬菜種類之一，其栽培面積大，經(jīng)濟效益好。而在不利環(huán)境下黃瓜葉片早衰，葉綠素降解，光合作用降低，嚴重影響黃瓜生長發(fā)育。作為葉綠素降解關鍵基因，挖掘脫鎂葉綠酸氧化酶基因(CsPAO)中與黃瓜成熟后期葉綠素組分含量的有利變異位點對解析黃瓜葉片衰老具有重要意義。本試驗通過研究黃瓜葉綠素降解關鍵酶(pheophorbide a oxygenase)基因CsPAO的表達模式，分析該基因在根、莖、葉、花、萼、須、果等不同組織中的特異性表達，重點分析在黑暗、溫度、SA等處理下該基因的表達特征，以期對闡述黃瓜葉綠素降解的分子機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

本試驗采用‘津春2號’黃瓜為材料，種子購自市場。該品種是天津市黃瓜研究所培養(yǎng)的第一代雜交品種，具有播種范圍廣，產(chǎn)量高，植株生長勢強，葉片較大而厚實，葉色深綠等特點。選取飽滿、整齊一致的種子，經(jīng)溫湯浸種后置于 30 ℃催芽箱黑暗放置 24 h，選取長勢良好，出芽一致的種子播于石英砂育苗穴盤中。溫度控制在 20～25 ℃/15～18 ℃(晝/夜)，相對濕度 60%～70%，自然光照射。

在幼苗長到二葉一心時定植于花盆中。定植后緩苗 3 d，待黃瓜幼苗生長到三葉一心時，將一部分幼苗分為5組，分別對葉面噴施摩爾濃度為100 μmol /L的ABA、GA3、JA、SA和等量清水，以噴施清水為對照。同時，另外一部分幼苗進行非生物脅迫處理：1)黑暗處理，將黃瓜幼苗置于黑暗環(huán)境中，保持溫度在 20～25 ℃/15～18 ℃(晝/夜)，相對濕度 60%～70%；2)低溫處理，將黃瓜幼苗置于4 ℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，保持相對濕度 60%～70%；3)高溫處理，將幼苗置于42 ℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，保持相對濕度 60%～70%。

試驗采用隨機排列，并進行3次重復，每個處理9株。分別于上述處理0.5、1、3、6、12和24 h取樣，將同一處理的每一盆各取第3片展開的功能葉(自上而下數(shù))，去掉葉脈和葉片邊緣，混合均勻，取約0.1 g葉片放入試管，并加2顆研磨珠。樣品迅速置于液氮，帶至實驗室低溫冰箱(-80 ℃)保存待用。同時分別取對照黃瓜幼苗的根、莖、葉、花、萼、須、果等不同組織，一并保存于低溫冰箱備用。

1.2 方 法

1.2.1 引物設計在葫蘆科作物基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.cucurbitgenomics.org/)搜索關鍵詞Pheophorbidea oxygenase，找到相應的基因CsaV3_1G014120，得到CsPAO基因CDS區(qū)的序列，再通過軟件Primer5設計合適的引物，RT-PAO-F和RT-PAO-R用于實時熒光定量PCR，PAO-F和PAO-R用于克隆全長。Actin作為內(nèi)參基因，設計引物Actin-F和Actin-R進行qRT-PCR(表1)。

1.2.2 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄將之前取好并保存于低溫冰箱中的樣品取出，將其放入研磨機中研磨成細粉，期間要不斷加入液氮防止樣品解凍。之后進行RNA提取，黃瓜葉片的提取參照Tiangen公司的RNAsimple Total RNA Kit試劑盒說明書進行。提取RNA的過程中注意經(jīng)常更換手套，使用無RNase的塑料制品和槍頭防止污染使RNA產(chǎn)量下降。提取出總RNA后，用Nanodrop 2000c測定總RNA的純度和質(zhì)量濃度并進行標記。參照TaKaRa公司的AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit)說明書合成cDNA。

1.2.3CsPAO基因CDS全長序列的獲得以1.2.2中逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行全長擴增，擴增體系為20 μL：Premix Taq (Ex Taq Version 2.0 plus dye) 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 7 μL。擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將獲得的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測目的片段。

1.2.4 實時熒光定量PCR以獲得的cDNA為模板，以黃瓜Actin為內(nèi)參基因，參照諾唯贊公司的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix說明書進行qRT-PCR分析，20 μL反應體系包含10 μLSYBR qPCR Master Mix、2 μL cDNA、0.8 μL+0.8 μL上下游引物、0.4 μL ROX和6 μL ddH2O。反應程序設置如下：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s循環(huán)反應40次；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s采集溶解曲線。試驗重復3次，采用2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達量。運用SPSS軟件(IBM SPSS statistics 17.0)進行統(tǒng)計學分析，采用3次重復的平均值和標準誤數(shù)據(jù)，用軟件Origin作柱狀圖。

表1 引物名稱及序列

1.2.5 生物信息學分析應用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對CsPAO基因全長進行翻譯獲得其所編碼的蛋白序列，利用blastp找到和黃瓜CsPAO蛋白序列相近的序列，選取最相近的10種植物，用DNAMAN 6.0 軟件進行多序列比較。用 NCBI 的 Protein Blast 軟件獲取CsPAO蛋白的保守區(qū)，可以得到其保守結(jié)構域。然后用MEGA 7軟件繪制系統(tǒng)進化樹。利用ProtParam tool(https://web.expasy. org/protparam/)軟件得到CsPAO 蛋白中每種氨基酸的含量、分子質(zhì)量、等電點，同時借助于 ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)軟件分析了CsPAO蛋白的氨基酸的親水性和疏水性。利用PredictProtein(http://www.predictprotein.org/)進行CsPAO 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構預測。借助于 SWISS-MODE(http://swissmodel. expasy.org/interactive)軟件預測了黃瓜CsPAO蛋白的三級結(jié)構。

1.2.6 亞細胞定位將1.2.3中獲得的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測目的片段，并進行目的片段的回收，采用 TaKaRa 公司的凝膠回收試劑盒回收。將膠回收產(chǎn)物與載體進行重組連接，并將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸肝菌DH5α感受態(tài)細胞，活化后涂布于含有卡那霉素(50 mg·L-1)的LB固態(tài)培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)進行單克隆菌液PCR驗證后，挑選陽性克隆子進行測序。測序正確后提取重組質(zhì)粒，采用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，用農(nóng)桿菌介導法侵染煙草葉片并進行CsPAO蛋白亞細胞定位觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsPAO基因的克隆

以PAO-F和PAO-R為上下游引物，用RT-PCR技術擴增得到1 638 bp目的片段(圖1)，其編碼545個氨基酸。

2.2 CsPAO基因?qū)に氐捻憫?/h3>

熒光定量 PCR 分析表明(圖2)，CsPAO響應GA3、SA和JA激素調(diào)控。GA3處理下CsPAO表達量表現(xiàn)出先下降后上升再下降的趨勢，下降后的表達量顯著低于對照，結(jié)論與赤霉素[17]可以通過抑制CsPAO基因表達的結(jié)論相一致。SA處理下黃瓜CsPAO基因表達呈現(xiàn)出逐步上升的趨勢，在24 h表達量達到最高值，說明SA激素通過提高CsPAO基因表達來加速葉綠素降解。值得注意的是，在JA處理下CsPAO基因表達呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，而ABA對CsPAO表達沒有影響，暗示植物體內(nèi)不同激素之間相互協(xié)調(diào)和平衡，以調(diào)控葉綠素的降解及植株衰老，如細胞分裂素、IAA、赤霉素及多胺等激素具有延緩葉綠素降解、延遲衰老的功能, 而乙烯、脫落酸、JA等植物激素具有促進葉綠素降解、加速衰老的功能，IAA與脫落酸相拮抗，赤霉素則可以促進 IAA的作用。因此，葉綠素降解可能是不同激素之間的互作的結(jié)果。

2.3 CsPAO基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應

由圖2可見，高溫和低溫脅迫條件下，CsPAO基因在12 h內(nèi)并沒有明顯變化，脅迫24 h 后CsPAO基因表達量顯著升高并達到最高值；黑暗脅迫下，與對照相比表達變化沒有顯著差異，表明CsPAO基因不受黑暗的誘導。本試驗結(jié)果表明，黃瓜在高溫處理和低溫處理下CsPAO的表達量顯著上升，同高溫[2]或低溫[3]可能引發(fā)葉綠素降解的報道一致，但本試驗中黑暗處理對CsPAO基因表達沒有影響，這與黑暗[5]可能引發(fā)葉綠素的降解的結(jié)論相悖，具體原因還有待進一步研究分析。

M. DL2000; 1. cDNA圖1 CsPAO基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of CsPAO gene

2.4 CsPAO基因的組織表達特性

實時定量PCR分析CsPAO基因在不同組織中的表達(圖3)，結(jié)果表明CsPAO基因在根、莖、葉、花、萼、須、果中均有表達，但在花器官中的表達量最高。可能的原因是花的存在時間短、代謝速度快，提高了CsPAO基因的表達量。

圖3 CsPAO的組織表達Fig.3 Expression levels of CsPAO in different tissues

不同小寫字母表示同一處理不同時間0.05水平差異顯著圖2 不同激素和逆境脅迫下CsPAO的相對表達量Different normal letters represent significant differences under different time points with same treatment at 0.05 levelFig.2 The relative expression of CsPAO under different hormones and environmental stresses

Ⅰ.黃瓜；Ⅱ.苦瓜；Ⅲ.南瓜；Ⅳ.筍瓜；Ⅴ.西葫蘆；Ⅵ.棗；Ⅶ.山麻黃；Ⅷ.溫州蜜柑；Ⅸ.胡桃；Ⅹ.甜橙；Ⅺ.楓香樹；Ⅻ.擬南芥；.歐洲油菜；煙草；XV.玉米圖4 16種植物的PAO蛋白的序列對比Ⅰ. Cucumis sativus； Ⅱ. Momordica charantia； Ⅲ. Cucurbita moschata； Ⅳ. Cucurbita maxima； Ⅴ. Cucurbita pepo subsp. pepo； Ⅵ. Ziziphus jujuba； Ⅶ. Trema orientale； Ⅷ. Citrus unshiu； Ⅸ. Juglans regia； Ⅹ. Citrus sinensis； Ⅺ. Liquidambar formosana； Ⅻ. Arabidopsis thaliana； . Brassica napus； . Nicotiana tabacum； XV. Zea maysFig.4 Sequence comparison of PAO proteins of 16 kinds of plants

2.5 黃瓜CsPAO基因編碼蛋白的生物信息學分析

2.5.1 CsPAO蛋白的基序分析用 NCBI 的 Protein Blast 軟件獲取CsPAO蛋白的保守區(qū)，可以得到其保守結(jié)構域。結(jié)果表明，CsPAO蛋白含有 PLN02518(Pheophorbide a oxygenase)、Rieske_RO_Alpha_CsPAO[Rieske non-heme iron oxygenase (RO) family]、HcaE (Phenylpropionate dioxygenase or related ring-hydroxylating dioxygenase)、Rieske[Rieske (2Fe-2S) domain]和nirD_assim_sml{nitrite reductase [NAD(P)H]}等結(jié)構域。

2.5.2 氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化分析利用 NCBI 數(shù)據(jù)庫對黃瓜CsPAO(Cucumissativus, XP_031740836.1)氨基酸同源序列進行了檢索和比對，發(fā)現(xiàn)其與同屬于葫蘆科黃瓜屬的甜瓜(Cucumismelo, XP_008462467.1)相似度最高，達到了95.6%。與同屬于葫蘆科的冬瓜(Benincasahispida, XP_038894382.1)、南瓜(Cucurbitamoschata, XP_022964963.1)、西葫蘆(Cucurbitapepo, XP_023519435.1)、苦瓜(Momordicacharantia, XP_022152935.1)、筍瓜(Cucurbitamaxima, XP_022970307.1) 相似度較高，分別為94.13%、92.11%、91.94%、91.77%和91.56%。通過DNAMAN6.0軟件中的多重比對功能，對黃瓜CsPAO蛋白的氨基酸序列與其他15個物種的氨基酸序列進行多序列比對(圖4)，結(jié)果顯示，PAO氨基酸中間區(qū)域保守性較高，兩端的氨基酸序列差異較大。通過MEGA 7軟件對系統(tǒng)進化樹進行分析，構建了黃瓜與其他15個物種的PAO氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖5)，結(jié)果顯示，PAO的進化基本符合植物分類學地位，且具有明顯的種屬特性。同為黃瓜屬的甜瓜、黃瓜聚為一組，同為葫蘆科植物PAO聚類較近，特別是與冬瓜、苦瓜、西葫蘆、南瓜、筍瓜等植物PAO蛋白相似度較高，而與玉米、歐洲油菜、擬南芥等植物相距較遠。

圖5 16種植物基因的PAO蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育關系Fig.5 Phylogenetic relationship of PAO protein sequences of 16 plant genes

2.5.3 CsPAO蛋白的理化特性和親/疏水性分析借助于ProtParam得到CsPAO基因編碼氨基酸545個，其中絲氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)的含量最高，分別為9.7%和8.3%，理論等電點為6.09，其蛋白相對分子質(zhì)量為61.02 kD，分子式C2746H4195N745O800S18。CsPAO蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為40.40，歸類為不穩(wěn)定蛋白。同時利用ProtScale在線分析了CsPAO蛋白的氨基酸的親疏水性，發(fā)現(xiàn)構成CsPAO蛋白的所有氨基酸的親水性(負值)和疏水性(正值)均分布在 -2.833～2.700，為親水性氨基酸。

2.5.4 CsPAO蛋白結(jié)構及亞細胞定位的預測利用PredictProtein進行CsPAO蛋白質(zhì)的二級結(jié)構預測，結(jié)果表明在CsPAO中α-螺旋占20.37%，β-折疊占12.11%，無規(guī)則卷曲占67.51%。同時預測到CsPAO具有2個蛋白結(jié)合位點，存在跨膜現(xiàn)象，亞細胞定位預測CsPAO蛋白定位于葉綠體膜。借助于 SWISS-MODE對黃瓜CsPAO蛋白的三級結(jié)構進行預測，預測出兩種三級結(jié)構模型(圖6)。

2.6 CsPAO蛋白的亞細胞定位

將構建好含有CsPAO與GFP融合蛋白載體的農(nóng)桿菌注射到煙草葉片，將侵染后的煙草置于光/暗時間為16 h/8 h、光/暗溫度為22 ℃/18 ℃條件下培養(yǎng)3 d后，使用激光共聚焦顯微鏡觀察，分析CsPAO蛋白的定位情況。結(jié)果顯示(圖7)：導入含目的基因CsPAO融合蛋白的煙草細胞，僅在葉綠體中呈現(xiàn)明顯的綠色熒光信號(圖7，B)，進而驗證了CsPAO蛋白定位于葉綠體，這與PredictProtein在線網(wǎng)站對CsPAO蛋白亞細胞定位的預測結(jié)果相一致。

3 討 論

葉綠素降解是植物體重要的生理活動，高溫[2]、強光[4]、干旱、活性氧代謝[18]等內(nèi)外因子對葉綠素降解代謝都會產(chǎn)生影響。脫鎂葉綠酸 a 加氧酶(pheophorbide a oxygenase，CsPAO)是葉綠素降解代謝的關鍵酶。在對擬南芥[19]和辣椒[20]的研究中發(fā)現(xiàn)，CsPAO蛋白結(jié)構的破壞，會使乙烯誘導衰老過程中葉綠素含量的減少。同時研究發(fā)現(xiàn)葉綠體基粒內(nèi)囊體膜上CsPAO蛋白活性缺失可以導致部分植物滯綠。此外，一些植物激素如赤霉素[17]、細胞分裂素[21]、茉莉酸[22]、茉莉酸甲酯[23]等都可以通過抑制CsPAO基因的表達，從而延遲了葉綠素含量的降低。這些結(jié)果顯示CsPAO基因參與調(diào)控多種不同植物中葉綠素降解代謝。

圖6 CsPAO 蛋白的三級結(jié)構預測結(jié)果Fig.6 Prediction results of tertiary structure of CsPAO protein

前人大量的研究結(jié)果已經(jīng)表明CsPAO基因能受到多種脅迫環(huán)境的誘導，甚至會受到多種激素如GA3[20]、ABA[24]乃至活性氧[17]等信號分子的響應。同時還發(fā)現(xiàn)不同的誘導因子對該基因的調(diào)控各有差異，不同物種的CsPAO基因在相同誘導因子作用下的表達模式也有所不同[14-16]。盡管前人已經(jīng)成功分離并克隆許多物種的CsPAO基因，并對其表達模式進行了初步探究，但是有關CsPAO基因在逆境脅迫下的具體作用機制則鮮有報道。我們的研究發(fā)現(xiàn)高溫和低溫脅迫能顯著誘導黃瓜CsPAO基因表達上調(diào)，表明黃瓜CsPAO蛋白在響應脅迫時可能發(fā)揮著重要作用。另外本試驗與同類研究相比增加了時間維度，處理結(jié)果不是簡單地與清水對照進行對比，試圖弄清環(huán)境脅迫和激素處理下，CsPAO基因的表達量隨時間變化產(chǎn)生的響應。通過qRT-PCR分析，我們進一步發(fā)現(xiàn)GA3和JA處理能更快地誘導黃瓜CsPAO基因的表達，表明CsPAO基因參與脅迫響應亦會引起某些信號分子的調(diào)控，總之，CsPAO基因在逆境中會發(fā)揮重要作用，且該基因的調(diào)控網(wǎng)絡較為復雜，有必要對其功能進行深入探究。

A為葉綠體自發(fā)熒光圖；B為GFP熒光激發(fā)圖；C為明場圖；D為疊加圖圖7 CsPAO蛋白的亞細胞定位A was shot in fluorescent field of the chloroplast autofluorescence; B was shot in fluorescent field of the GFP; C was shot in bright field; D was shot in merged fieldFig.7 Subcellular localization of CsPAO protein

對黃瓜CsPAO蛋白的結(jié)構和功能進行預測的結(jié)果表明，CsPAO蛋白不穩(wěn)定，含跨膜結(jié)構域預測該蛋白在葉綠體膜上發(fā)揮作用。此外，通過同源建模的方法，建立了黃瓜CsPAO的三維結(jié)構，為進一步鑒定其功能奠定了基礎。之后可以通過構建融合蛋白載體，在激光掃描共聚焦顯微鏡的激光照射下GFP蛋白會發(fā)出綠色熒光，從而可以精確地定位蛋白質(zhì)的位置。還可以通過構建黃瓜CsPAO基因沉默載體和過表達載體，來沉默或過表達CsPAO基因，或者利用CRISPR-Cas9基因編輯技術來敲除CsPAO基因，以進一步研究CsPAO基因在黃瓜葉片葉綠素降解中所起的作用。