玉米跨代干旱脅迫記憶生理機制及DNA甲基化變化分析

王 霞，尹曉雨，于曉明，劉曉丹

(吉林農業科技學院，吉林 吉林 132101)

玉米(ZeamaysL.)不僅是中國三大糧食作物之一，還是重要的飼料作物和工業原料，是目前世界上產量最大的禾谷類作物，在國民經濟中占有非常重要的地位。作為旱地農作物，玉米的需水量非常大，對環境中的水分缺失很敏感[1]。隨著全球干旱問題日益嚴重，干旱已經成為制約玉米產量的首要因素，中國約有60%的玉米種植面積受到干旱脅迫[1]。作為中國玉米主產區，吉林省西部有一半以上的干旱地沒有得到開發利用。研究玉米的抗旱機制、培育抗旱新品種是目前亟待解決的問題，而弄清玉米跨代干旱脅迫記憶機制是解決這一問題的重要途徑。

脅迫記憶(stress imprint)是指植物在經歷初始脅迫后，當再次面對生物和非生物脅迫(干旱、冷凍、高溫、高鹽等)時會產生更高耐受性的現象[2]。2015年，Ramírez[3]等發現經多次干旱脅迫后的馬鈴薯擁有更強的抗氧化性，同樣，研究者們在小麥[4]、葡萄[5]、馬鈴薯[5]等多種植物中陸續發現它們對過去經歷的逆境脅迫具有記憶效應。2018年，“植物對逆境的記憶功能與進化”入選中國科學技術協會的60個重大科學問題和工程技術難題，掀起了脅迫記憶相關研究的熱潮。研究發現，脅迫記憶可能是短期的，也可能是長期的，短期記憶不能遺傳，但可以提高植物對逆境的適應能力，長期記憶卻可以通過一種未知的機制傳遞給子代，產生跨代脅迫記憶，使植物能夠更快更強地應對逆境[3]。目前，大量證據表明，植物會對當代脅迫產生印記并表現出更為強烈的抵御機制[3-6]，但是關于跨代脅迫記憶方面的研究報道卻不多。2009年，Whittle等[7]發現F0及F1代擬南芥經高溫脅迫后，其F3代仍具有較強的抵抗高溫的能力；2015年，Shi等[8]發現水稻經高溫脅迫鍛煉后，其子代對高溫的耐受性明顯增強；2019年，Cong等[9]的研究表明，由重金屬脅迫引起的水稻HMA基因表達上調產生了跨代脅迫記憶，這種現象同樣也在馬鈴薯[3]、擬南芥[10]中被發現。

迄今，植物脅迫記憶產生與維持的具體機制尚不清楚。現有研究表明，脅迫記憶的產生和維持與脅迫誘導的代謝產物、DNA甲基化及組蛋白修飾等有關[11]。作為最重要的表觀遺傳修飾之一，DNA甲基化修飾在植物非生物脅迫應答中的作用引起了研究者們的極大興趣。2016年，Wibowo等[12]發現，鹽脅迫可以引起擬南芥產生跨代脅迫記憶，且這種記憶的產生與維持和特定DNA的超甲基化有關，且當鹽脅迫消失時，DNA的超甲基化也會逐漸消失；2019年，Li等[13]發現水稻經多次干旱脅迫后，約3 000多個記憶轉錄本與DNA甲基化調控有關。對脅迫記憶中DNA甲基化變化機制的深入研究，可以為我們從表觀遺傳修飾層面改良植物抗逆性奠定基礎。目前，針對玉米跨代脅迫記憶的研究尚無報道，本試驗以玉米模式自交系B73和H99為研究對象，通過分析2個玉米品種G0和G1代響應干旱脅迫時生理指標和基因組DNA甲基化修飾的變異和傳遞規律，為后續跨代脅迫記憶機制研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

1.1.1 試驗材料參試玉米自交系B73和H99均為引自美國的玉米經典自交品系，兩者均較早完成基因組測序，都為玉米育種的種質基礎，試驗種子由吉林省農業科學院提供。

1.1.2 干旱鍛煉參試材料為B73和H99在正常水分條件下套袋授粉獲得單株種子，采用紙皿法發芽，待胚芽破胸露白時，每個品種挑選300粒發芽良好的種子，進行干旱鍛煉。每天上午9:00將發芽種子置于干濾紙上，于22 ℃光照培養箱(光照強度400 μmol·m-2·s-1、濕度60%)中干旱鍛煉1 h，然后置于濕紗布中，每天鍛煉1次，連續鍛煉4 d(1 h→2 h→3 h→4 h)，累計鍛煉4 h，對照組(0 h)不進行干旱鍛煉(圖1，A)，之后2類經過處理的發芽種子均栽種于吉林農業科技學院玉米試驗田，經套袋授粉后分別獲得子代種子，分別記為G0(對照)和G1(鍛煉)代。

1.1.3 干旱脅迫處理G0和G1代玉米種子采用紙皿法催芽后種植，待幼苗長至五葉一心時，取出幼苗，洗凈根部泥沙，將幼苗根部放入1/2MS液體培養基中適應2 d，然后移入含20% PEG-6000的1/2MS液體培養基中，分別在浸泡0、1、2、3、4、5 h后(圖1,B)，隨機取16棵玉米幼苗第四葉混樣，保存于-80 ℃中備用。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 生理指標采用飽和稱重法測定葉片相對含水量(relative water content, RWC)[6]，硫代巴比妥酸法測定丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量[14]，蒽酮法測定可溶性糖含量[15]，茚三酮顯色法測定脯氨酸含量[15]，氮藍四唑(NBT)法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性[15]，愈創木酚法測定過氧化物酶(peroxidase，POD)活性[14]，設3個重復。

1.2.2 DNA甲基化敏感擴增多態性(MSAP)采用改良CTAB法提取玉米葉片基因組DNA，參照孫麗芳等[16]的方法進行MSAP分析，設3個重復。參照Zhang等[17]的方法，統計并分析DNA甲基化水平和模式變異情況，EcoRⅠ、HpaⅡ和MspⅠ購自大連寶生物，接頭及引物均由上海生工公司合成，序列見表1。

圖1 玉米自交系B73在干旱鍛煉(A)與干旱脅迫(B)后的表型變化Fig.1 Phenotypic changes of maize self-bred line B73 after drought hardening (A) and drought stress (B)

表1 MSAP用的接頭及引物序列

1.3 抗旱性綜合評價

依據生理指標數據采用隸屬函數法[18]進行玉米幼苗抗旱性綜合評價，公式為：

指標與抗性正相關：

X(u) = (X-Xmin) /(Xmax-Xmin)；

指標與抗性負相關：

X(u) =1- (X-Xmin) /(Xmax-Xmin)。

其中，X為指標平均值，Xmax、Xmin分別為指標最大值和最小值。

1.4 數據分析

用Excel 2010作圖，單因素方差分析與顯著性檢驗(Duncan法，P<0.05)用SPSS26.0軟件。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對G0和G1代玉米幼苗葉片相對含水量(RWC)的影響

由圖2，A可知，所有材料葉片RWC均隨脅迫時間延長呈逐漸下降趨勢，且各干旱脅迫處理時期均存在顯著性差異(P<0.05)。同一玉米品種內相比較，G1代葉片RWC在未經脅迫時稍高于G0代(P>0.05)，在經過相同時間干旱脅迫后均顯著高于G0代(P<0.05)；在脅迫5 h時，B73和H99玉米 G1代葉片RWC分別是G0代的1.14和1.09倍，且2個品種G1代葉片RWC的降幅均小于G0代。在品種間相比較，經過相同時間干旱脅迫后，B73自交系 G1和G0代葉片RWC均高于H99，它們葉片RWC降幅也均顯著低于H99自交系。

2.2 干旱脅迫對G0和G1代玉米幼苗葉片MDA含量的影響

干旱脅迫可顯著提高兩個玉米自交系葉片MDA含量(圖2，B)。隨干旱脅迫時間延長，所有材料葉片MDA含量均呈顯著上升趨勢(P<0.05)；對于同一玉米自交系，其G1代葉片MDA含量在未經脅迫時稍低于G0代(P>0.05)，在經過相同時間脅迫后均顯著低于G0代(P<0.05)；在脅迫5 h時，B73和H99 自交系G1代葉片MDA含量分別是G0代的0.85和0.90倍，且2個自交系G1代葉片MDA含量增幅均小于G0代。在品種間相比較，經過相同時間干旱脅迫后，B73 自交系G1和G0代葉片MDA含量均顯著低于H99自交系(P<0.05)。

2.3 干旱脅迫對G0和G1代玉米幼苗葉片對可溶性糖和脯氨酸含量的影響

干旱脅迫可顯著提高玉米自交系葉片可溶性糖含量，且所有材料葉片可溶性糖含量均隨著脅迫時間延長呈上升趨勢(圖2，C)。除未經脅迫時，H99玉米自交系G1代葉片可溶性糖含量稍高于G0代(P>0.05)外，同一玉米自交系經過相同時間脅迫后G1代葉片可溶性糖含量均顯著高于G0代(P<0.05)；在干旱脅迫5 h時，B73和H99 自交系G1代葉片可溶性糖含量分別是G0代葉片的1.17和1.11倍，且2個自交系G1代葉片可溶性糖增加量高于G0代。經過相同干旱脅迫后，B73 玉米自交系G1和G0代葉片可溶性糖含量均顯著高于H99自交系(P<0.05)。

不同字母表示處理材料及時間之間在0.05水平差異顯著(P<0.05)，下同圖2 B73和H99玉米自交系G0、G1代幼苗葉片4個生理指標比較Different normal letters indicate significant differences among materials and times at 0.05 level(P<0.05), the same as belowFig.2 Comparison of four main indexes in leaves of G0 and G1 generation seedlings from maize self-bred line B73 and H99

同時，圖2，D顯示，干旱脅迫可提高玉米自交系葉片脯氨酸含量，且所有材料葉片脯氨酸含量均隨脅迫時間延長呈逐漸上升趨勢。對于同一玉米自交系，G1代葉片脯氨酸含量在未經干旱脅迫時稍高于G0代(P>0.05)，在經過相同時間脅迫后均顯著高于G0代(P<0.05)；在干旱脅迫5h時，B73和H99 玉米自交系G1代葉片脯氨酸含量分別是G0代的1.23和1.16倍，且2個自交系G1代葉片脯氨酸增加量也均高于G0代。自交系間相比較，經過相同時間干旱脅迫后，B73 玉米自交系G1和G0代葉片脯氨酸含量均顯著高于H99自交系(P<0.05)。

2.4 干旱脅迫對G0和G1代玉米幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

2.4.1 SOD活性的影響由圖3，A可知，隨干旱脅迫時間延長，所有材料葉片SOD活性均呈先升后降趨勢，并均在脅迫4 h時達到最高，此時B73和H99 自交系G1代葉片SOD活性分別是G0代的1.04和1.02倍；就同一玉米自交系而言，G1代葉片SOD活性在未經干旱脅迫時稍高于G0代(P>0.05)，在經過相同時間干旱脅迫后均顯著高于G0代(P<0.05)，且G1代葉片SOD活性增加量均高于G0代。經過相同時間干旱脅迫后，B73 自交系G1和G0代葉片SOD活性均顯著低于H99自交系(P<0.05)，但是B73 葉片G1和G0代SOD活性增加量卻明顯高于H99自交系。

2.4.2 POD活性圖3，B顯示，隨干旱脅迫時間延長，所有材料葉片POD活性均呈先升后降趨勢，并均在脅迫3 h時達到最高值，此時B73和H99 自交系G1代葉片POD活性分別是G0代的1.10和1.06倍；在同一玉米自交系內，G1代葉片POD活性在未經干旱脅迫處理時稍高于G0代(P>0.05)，在干旱脅迫處理1 h時，H99自交系 G1代葉片POD活性稍高于G0代(P>0.05)，其余處理組G1代POD活性均顯著大于G0代(P<0.05)，且G1代葉片POD活性增加量也均高于G0代。另外，經過相同時間干旱脅迫后，B73自交系 G1和G0代葉片POD活性均顯著低于相應的H99自交系(P<0.05)，而B73 自交系G1和G0代葉片POD活性增加量卻明顯高于相應的H99自交系。

2.5 干旱脅迫對G0和G1代玉米幼苗葉片DNA甲基化修飾的影響

從48對引物中篩選出20對高多態性引物進行PCR擴增，B73和H99玉米自交系的擴增總條帶數分別為632和589，平均每對引物擴增條帶數分別為31.60和29.45，2個玉米自交系經干旱脅迫后，同一自交系相同世代DNA甲基化水平及模式變化均不明顯，故實驗只統計干旱脅迫0、1、3、5h的甲基化狀況。

2.5.1 DNA甲基化水平由圖4可知，隨干旱脅迫時間延長，B73 自交系2個世代(G0和G1代)CG、CHG甲基化水平，以及H99 自交系2個世代CG甲基化水平均呈緩慢上升趨勢，H99 自交系2個世代CHG甲基化水平均呈緩慢下降趨勢，但其變化均未達到顯著水平(P>0.05)；干旱脅迫期間，B73 自交系G1代CG+CHG甲基化水平(平均值30.30%)略高于G0代(平均值30.21%)，H99 自交系G1代CG+CHG甲基化水平(平均值29.96%)略低于G0代(平均值30.10%)，B73和H99 自交系G1代CG、CHG甲基化水平變化量均大于G0代，但其變化均未達到顯著水平(P>0.05)。

圖3 B73和H99玉米自交系G0、G1代葉片抗氧化酶活性比較Fig.3 Comparison of antioxidant enzyme activities between G0 and G1 generation seedlings from maize self-bred line B73 and H99

2.5.2 DNA甲基化模式植物基因組DNA甲基化主要以胞嘧啶甲基化為主，其模式有CG超甲基化(CG hyper)、 CG去甲基化(CG hypo)、 CHG超甲基化(CHG hyper)、CHG去甲基化(CHG hypo)、both hyper和both hypo 6種。由圖5可知，干旱脅迫可引起B73和H99 玉米自交系2個世代DNA甲基化模式發生顯著變化(P<0.05)；隨干旱脅迫時間延長，所有材料6種DNA甲基化模式的變化均緩慢增強，G1代DNA甲基化模式變化均稍高于G0代；B73 自交系2個世代DNA甲基化模式均以CG hypo和CHG hypo變化為主，其次是CHG hyper和CG hyper變化，而H99 自交系2個世代均以CHG hypo和CG hyper變化為主，其次是CG hypo和CHG hyper變化；2個自交系G1和G0代的DNA甲基化模式both hypo與both hyper 變異率均極低。其中，經20%PEG干旱脅迫5 h，B73 自交系G1和G0代的甲基化模式總變異率分別為3.090%和0.208%，H99 自交系G1和G0代的甲基化模式總變異率分別為3.562%和0.223%，B73 自交系2個世代整體甲基化模式變異率小于H99自交系。

圖4 B73和H99玉米自交系G0、G1代葉片基因組DNA甲基化水平比較Fig.4 Comparison of DNA methylation levels of G0 and G1 generation seedlings from maize self-bred line B73 and H99

圖5 B73和H99玉米自交系G0、G1代葉片基因組DNA甲基化模式比較Fig.5 Comparison of DNA methylation patterns of G0 and G1 generation seedlings from maize self-bred line B73 and H99

表2 4份玉米材料的抗旱隸屬函數值

2.6 玉米自交系G0和G1代幼苗抗旱性綜合評價

目前尚無植物抗旱性評價的標準指標，干旱環境下植物的生理變化非常復雜，利用單一生理指標評價抗旱性并不科學，隸屬函數法是以各生理指標隸屬度的平均值作為標準來評價植物的抗旱性，平均值越高，抗旱性越強[18]。兩個玉米自交系G0和G1代6個指標的隸屬函數計算結果(表2)顯示，4份材料的抗旱性由強到弱依次為：B73 G1代>B73 G0代>H99 G1代>H99 G0代，說明B73和H99自交系經干旱鍛煉后，其自交后代的抗旱性均有所增強，且B73抗旱性高于H99。

3 討 論

3.1 干旱鍛煉對玉米自交系G1代響應干旱脅迫時生理指標的影響

已有的干旱脅迫經歷可能會改變植物應對干旱脅迫的生理反應。RWC是直接評價植物保水能力的指標，RWC值越小，說明植物缺水越嚴重，受干旱脅迫損傷程度越深[19]，因此RWC常被用于評價植物的抗旱性。Ding等研究發現，經多次短時干旱鍛煉后，玉米[6]和擬南芥[20]當代葉片RWC均明顯提高。本實驗中，在干旱脅迫條件下，B73和H99 玉米自交系G1代葉片RWC均顯著高于G0代，說明G0代干旱鍛煉提高了G1代葉片的保水能力。可以推測，一定強度的干旱鍛煉可以提高玉米植株當代、甚至其子代葉片的保水能力。同時，B73和H99 玉米自交系G1和G0代葉片RWC隨干旱脅迫強度增加顯著下降，具有一定的劑量效應。

缺水可以引起植物細胞內活性氧的大量累積[21]，引發膜脂過氧化反應，該反應的最終產物MDA會破壞膜的結構和功能，甚至導致植物死亡。因此，MDA含量是衡量植物受干旱傷害程度的重要指標[14]。與此同時，多數植物還擁有一套清除活性氧的抗氧化保護系統，其主要成員有SOD和POD等抗氧化酶，干旱條件下植物可以通過增加這些抗氧化酶的活性來避免或減輕干旱帶來的傷害[21]。本實驗結果表明，干旱脅迫可以引起B73和H99玉米自交系葉片的膜損傷，改變其抗氧化酶活性，同時，與G0代相比，B73和H99 自交系G1代經歷干旱脅迫時的MDA含量增加速度均明顯減緩，SOD和POD活性均明顯提高，說明G0代玉米干旱鍛煉可提高G1代的抗氧化能力，降低由干旱脅迫帶來的膜傷害，這與擬南芥[17]、馬鈴薯[5]、小麥[18]的相關研究結果一致。另外，本實驗中，當干旱脅迫超過4 h后，所有材料葉片的SOD和POD活性均開始下降，證明高強度干旱脅迫會破壞植物的自身抵御能力[22]。

滲透調節機制同樣是植物適應干旱的重要途徑，植物借助脯氨酸、可溶性糖等滲透調節物質使細胞維持一定的膨壓，使膜蛋白維持正常結構、參與活性氧的清除[21]。因此，研究者們認為由逆境引起的滲透調節物質的累積與植物的抗旱性成正相關[14]。本實驗恰好證明了這一結論：B73和H99 自交系G1代再次經歷干旱脅迫時，其葉片脯氨酸和可溶性糖含量均明顯高于G0代，即親代干旱鍛煉可增加玉米自交后代滲透調節物質的累積，降低細胞滲透勢，利于細胞保水，這與在小麥[18]上相關的研究結果一致。

3.2 干旱鍛煉對玉米自交系G1代響應干旱脅迫時DNA甲基化修飾的影響

DNA甲基化修飾不僅參與植物對逆境脅迫的應答，還參與植物抗逆脅迫記憶的形成與維持，現已在水稻[23]、番茄[24]、擬南芥[25]中發現了與DNA甲基化修飾相關的基因參與了抗逆應答； Wibowo等[12]則發現水稻跨代鹽脅迫記憶與特定區域DNA超甲基化有關；Herman與Boyko則分別證明DNA甲基化介導了桃葉寥[26]和擬南芥[10]的跨代干旱脅迫記憶。本實驗中，同一玉米自交系2個世代DNA甲基化水平變化趨勢相同，但是G1代DNA甲基化修飾變化大于G0代，與水稻[27]的相關研究結果吻合。在干旱脅迫下，B73和H99 玉米自交系2個世代基因組DNA甲基化水平和甲基化模式的變化并不明顯，推測DNA甲基化修飾的改變可能需要相對較長時間，同時B73和H99甲基化修飾響應脅迫的變異規律并不相同，證明了Ferreira提出的DNA甲基化動態變化與基因型有關的說法[28]。

與G0代相比，2個玉米自交系G1代葉片CG、CHG甲基化修飾均更不穩定，G1代抗旱性均有所增強，說明G0代的干旱鍛煉在G1代體內留有印記，當再次遭受干旱逆境時，可以產生更快更強的DNA甲基化變化，啟動自身防御系統，提升保水能力，避免或減緩傷害，進而表現出更強的抗旱性。本研究從生理和DNA甲基化修飾視角分析了干旱鍛煉對玉米自交后代抗旱性的影響，為玉米抗旱新品種培育及植物跨代脅迫記憶機制研究奠定了基礎。