食品中霉菌檢測(cè)方法的改進(jìn)研究

劉勝桃，宋 鴿，王秀艷，李慧娟，常建軍，王 宏

（蒙牛乳業(yè)（沈陽(yáng)）有限責(zé)任公司，遼寧沈陽(yáng) 110122）

霉菌是絲狀真菌的統(tǒng)稱(chēng)，廣泛分布于土壤、水、空氣等自然環(huán)境中[1-3]，因此食品極易被霉菌污染[4]。霉菌可引起食品、農(nóng)產(chǎn)品的發(fā)霉變質(zhì)，霉菌毒素可導(dǎo)致慢性中毒具有致癌、致畸、致突變作用[5]，可對(duì)人體健康造成危害[6-12]。霉菌的監(jiān)測(cè)也成為食品檢驗(yàn)技術(shù)與食品衛(wèi)生質(zhì)量評(píng)價(jià)中的重要組成部分[13-16]，我國(guó)先后5次修訂了食品中霉菌計(jì)數(shù)的方法標(biāo)準(zhǔn)[17-21]，據(jù)此我國(guó)各級(jí)監(jiān)督檢測(cè)機(jī)構(gòu)全面開(kāi)展食品中霉菌的檢測(cè)工作，自《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）實(shí)施以來(lái)將原標(biāo)準(zhǔn)中倒置平板培養(yǎng)改成正置平板培養(yǎng)，霉菌培養(yǎng)中的污染和培養(yǎng)基干裂現(xiàn)象頻發(fā)，這主要是因?yàn)槊咕淇僧a(chǎn)生數(shù)量巨大的孢子，同時(shí)霉菌的孢子具有小、輕、干、多、休眠期長(zhǎng)和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，任何一個(gè)孢子在適宜條件下都能發(fā)展成新的個(gè)體。常規(guī)霉菌檢測(cè)的培養(yǎng)過(guò)程中，以及觀察移動(dòng)過(guò)程中，不可避免地造成空氣流動(dòng)，霉菌孢子可趁機(jī)飄散進(jìn)入空氣中并隨處散播、繁殖，引起嚴(yán)重的交叉污染和外部侵染[22]。又因霉菌的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)基在培養(yǎng)過(guò)程中水分損失較大，即使加大了培養(yǎng)基的傾注量，也無(wú)法避免培養(yǎng)基干裂，從而導(dǎo)致影響菌落計(jì)數(shù)的問(wèn)題，而目前這兩項(xiàng)常見(jiàn)且棘手的問(wèn)題始終困擾著相關(guān)人員，且無(wú)有效的控制 措施。

本實(shí)驗(yàn)室在日常霉菌檢測(cè)中采取兩種隔離培養(yǎng)方法，即膜包裹法、培養(yǎng)盒法，對(duì)霉菌孢子擴(kuò)散、污染及培養(yǎng)基干裂的控制效果顯著，且成本低廉，操作簡(jiǎn)便，對(duì)比《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)國(guó)標(biāo)法）的計(jì)數(shù)結(jié)果，探討霉菌檢測(cè)過(guò)程中隔離式培養(yǎng)方法的可行性、實(shí)用性和準(zhǔn)確性[23-27]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來(lái)源

霉菌和酵母質(zhì)控樣（QC-FD-020），來(lái)自中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心；霉菌和酵母質(zhì)控樣（A062018M），來(lái)自北京美正檢測(cè)技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑

孟加拉紅瓊脂，CM164，北京陸橋技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.3 耗材

霉菌培養(yǎng)盒，食品級(jí)PVC材質(zhì)，分為4個(gè)凹槽，凹槽與培養(yǎng)皿直徑及高度相匹配，每個(gè)凹槽有3個(gè)透氣孔，培養(yǎng)過(guò)程中形成有氧培養(yǎng)環(huán)境，此裝置為一次性使用，計(jì)數(shù)后的培養(yǎng)皿連同裝置一同高壓滅菌處理即可；保鮮膜或封口膜。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC-1300IIB2生物安全柜（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SSW-600-2S恒溫水箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；MJX-250BⅢ霉菌培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；MSⅢ basic漩渦混合器（德國(guó)IKA）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 膜包裹培養(yǎng)法

稱(chēng)取25 g樣品加入225 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分振搖，制成1∶10樣品勻液，取1∶10樣品勻液1 mL，加入含有9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，旋渦混勻，制成1∶100的樣品勻液，同時(shí)做空白對(duì)照，及時(shí)傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，在潔凈室中將平皿4～6個(gè)疊放，外層包裹保鮮膜或封口膜，在疊放的皿與皿之間用刀劃上長(zhǎng)約2 cm的透氣孔，每層劃2～3個(gè)透氣孔，正置平板，置（28±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)以直接培養(yǎng)法的樣品作為對(duì)照，觀察并記錄培養(yǎng)至第5 d的結(jié)果。

1.3.2 霉菌盒培養(yǎng)法

稱(chēng)取25 g樣品加入225 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分振搖，制成1∶10樣品勻液，取1∶10樣品勻液1 mL，加入含有9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，旋渦混勻，制成1∶100的樣品勻液，同時(shí)做空白對(duì)照，及時(shí)傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后將平皿正置于霉菌盒中，每個(gè)槽可放置一個(gè)培養(yǎng)皿，將上蓋蓋嚴(yán)即可放入（28±1）℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，同時(shí)以直接培養(yǎng)法的樣品做對(duì)照，觀察并記錄培養(yǎng)至第5 d的結(jié)果。

1.3.3 直接培養(yǎng)法

稱(chēng)取25 g樣品加入225 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分振搖，制成1∶10樣品勻液，取1∶10樣品勻液1 mL，加入含有9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，旋渦混勻，制成1∶100的樣品勻液，同時(shí)做空白對(duì)照，及時(shí)傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，正置平板，置（28±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)以直接培養(yǎng)法的樣品作對(duì)照，觀察并記錄培養(yǎng)至第5 d的結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜包裹培養(yǎng)法、霉菌盒培養(yǎng)法與直接培養(yǎng)法結(jié)果比較

對(duì)8組不同類(lèi)型的樣品（已知不含菌樣品）進(jìn)行霉菌檢測(cè)，同時(shí)監(jiān)控5組空白實(shí)驗(yàn)，每組樣品每個(gè)稀釋度均進(jìn)行兩組平行檢測(cè)，用膜包裹培養(yǎng)法和霉菌盒裝置培養(yǎng)的8組實(shí)驗(yàn)樣品及5組空白對(duì)照，均未出現(xiàn)污染、培養(yǎng)基干裂的情況，同時(shí)使用菌片法進(jìn)行檢驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果一致。而采用直接法培養(yǎng)的13組樣品，10組樣品出現(xiàn)不同程度的污染，部分培養(yǎng)基干裂，樣品污染情況占比69%，培養(yǎng)基干裂數(shù)量占 比77%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，膜包裹培養(yǎng)法和霉菌盒裝置培養(yǎng)法均可將環(huán)境中的污染來(lái)源完全隔離，且可以保證在較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)降低培養(yǎng)基水分的損失。但霉菌盒裝置在結(jié)果觀察過(guò)程無(wú)需打開(kāi)培養(yǎng)盒，可直接透過(guò)培養(yǎng)盒清晰地對(duì)菌落進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，達(dá)到從樣品培養(yǎng)到出具結(jié)果，最終到廢棄物處理環(huán)節(jié)，培養(yǎng)物與外界環(huán)境始終保證有效的隔離，避免了環(huán)境、樣品、人員相互污染的風(fēng)險(xiǎn)。膜包裹培養(yǎng)法、霉菌盒正置培養(yǎng)法與直接法培養(yǎng)結(jié)果如表1所示。

表1 膜包裹培養(yǎng)法、霉菌盒正置培養(yǎng)法與直接法培養(yǎng)結(jié)果

2.2 膜包裹培養(yǎng)法、霉菌盒培養(yǎng)法準(zhǔn)確性測(cè)試

使用膜包裹培養(yǎng)法及霉菌盒培養(yǎng)法對(duì)6組不同特性區(qū)間及不同廠家的霉菌質(zhì)控樣品進(jìn)行檢測(cè)，每組樣品、每個(gè)稀釋度均進(jìn)行兩組平行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均在質(zhì)控樣品特性區(qū)間，將膜包裹培養(yǎng)法得到的結(jié)果與霉菌盒培養(yǎng)法得到的結(jié)果配對(duì)T檢驗(yàn)，P=0.18＞0.05，表明無(wú)顯著性差異；培養(yǎng)過(guò)程中未出現(xiàn)培養(yǎng)基干裂及污染的現(xiàn)象，空白對(duì)照均無(wú)菌落生長(zhǎng)，證明了兩種隔離培養(yǎng)方式不會(huì)對(duì)霉菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，如表2所示。

表2 膜包裹培養(yǎng)法及霉菌盒培養(yǎng)法質(zhì)控評(píng)價(jià)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)對(duì)膜包裹法、霉菌盒培養(yǎng)法、直接培養(yǎng)法培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)膜包裹法、霉菌盒培養(yǎng)法可有效解決在培養(yǎng)過(guò)程中水分流失造成的培養(yǎng)基干裂問(wèn)題，且無(wú)污染，同時(shí)對(duì)質(zhì)控樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)上述兩種隔離培養(yǎng)方式不影響菌落計(jì)數(shù)，不影響霉菌的生長(zhǎng)。因膜包裹法觀察過(guò)程中需要將膜拆開(kāi)，而霉菌盒培養(yǎng)法較膜包裹法的優(yōu)勢(shì)在于在觀察和計(jì)數(shù)過(guò)程中不需要打開(kāi)霉菌盒裝置，透過(guò)裝置可清晰對(duì)菌落進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，從平板培養(yǎng)到最終廢棄物處置，培養(yǎng)物與外界環(huán)境始終保證有效的隔離措施，避免了環(huán)境、樣品、人員相互污染的風(fēng)險(xiǎn)。操作方便、成本低廉，霉菌培養(yǎng)盒也可應(yīng)用于培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)和（或）溫度較高的微生物檢測(cè)項(xiàng)目，例如嗜熱需氧芽孢檢測(cè)等，是實(shí)驗(yàn)室值得推廣的培養(yǎng)方法。