小鼠無精癥模型的研究進展

徐源鴻 邵明廣 王天陽 李思強 李恩中

(黃淮學院生物與食品工程學院 463000)

精子發生（Spermatogenesis）是由精原干細胞（Spermatogonial Stem Cells,SSCs）經過嚴格調控的自我更新和分化成為成熟精子的過程[1]。同時，精子發生是一個復雜、精密調控的過程，一旦發生異常將會導致無精癥、弱精癥和少精癥等癥狀，引起雄性不育[1]。雄性不育不僅制約畜牧業的發展，還危及人類健康，世界衛生組織數據顯示，全球有10%～15%的育齡夫婦存在不孕不育問題，而男性不育占50%，已成為影響人類健康的第三大疾病[2]。目前，雄性不育的發病機制還不清楚，治療效果不理想，尚需對其原因、機制及治療手段等進行更加深入的研究。但雄性不育動物模型的構建與獲得是開展該類研究的基礎與前提。小鼠無精癥模型在研究雄性不育發病機制及相關保健或治療性藥物篩選方面發揮重要作用，是研究雄性不育的重要模型[3]。由于不同的構建方法顯著影響小鼠無精癥模型的建立，如穩定性差異較大、對其他器官的影響不同等[4-8]，甚至同一建模方法也會產生較大的個體差異[9-11]，顯著影響后續研究的準確性。因此，本文從化學方法（化療藥物）、物理方法（放射性射線、隱睪手術）及生物方法（轉基因動物）建立小鼠無精癥模型的研究進展進行綜述，并分析具體方法的特點，以期為無精癥動物模型研究、產生機理及藥物篩選等方面的研究提供一定的參考。

1 化學方法

由于精子發生易受某些化療藥物（如抗癌劑）的抑制，所以以化療藥物構建無精癥動物模型的方法有效可行[10]。此外，注射化療藥物簡單易行，對實驗人員的操作熟練度要求相對較低。因此，以化療藥物構建無精癥模型已成為現在最主流的方法之一。

1.1 白消安

白消安（Busulfan,BU）又稱馬利蘭，為氮芥類烷化劑甲基磺酸酯類的代表藥物。臨床上主要用于治療慢性粒細胞白血病及造血干細胞移植預處理和抗腫瘤等[4,12]。由于白消安可以使DNA 單鏈和雙鏈交聯，精原干細胞在G0/G1 期發生阻斷，可用于無精模型的構建。

常用的白消安建模濃度為10、20、30、40、50mg/kg[5,13-18]，通過試驗證實，單次腹腔注射50mg/kg 劑量為致死劑量[17]。Zhao 等單次腹腔注射30mg/kg 濃度的白消安后發現一重要糖酵解酶（PGAM1）的表達量下調[14]；由于P53、Caspase 3、Caspase 6 和Caspase 9 與細胞凋亡相關，并且當PGAM1 表達量下降后，上述細胞凋亡信號被激活放大，故推測PGAM1 通過上述凋亡途徑來引起生精細胞凋亡。Olfati 等通過使用30mg/kg白消安成功構建了小鼠無精癥模型，并使用促卵泡生成激素（Follicle-stimulating Hormone,FSH）和雌二醇（Estradiol2,E2）處理模型小鼠后發現，其在一定程度上使試驗小鼠恢復了精子發生的能力，表明促卵泡生成激素（FSH）和雌二醇（E2）可能具有降低白消安效應的能力[15]。王得志優化了白消安的最適濃度，通過構建5 個濃度梯度的無精癥模型發現，注射30mg/kg 白消安后第4 周末絕大多數睪丸單倍體細胞被排除，少部分生精細胞仍留在體內，且在該濃度下小鼠的死亡率（6.5%）在接受范圍內，因而確定了30mg/kg 白消安濃度為最佳的小鼠無精癥建模濃度[17]。參見表1。后有關學者更改了40mg/kg 濃度白消安的注射方式，將單次腹腔注射改為3h 內分兩次腹腔注射，且考慮到溶劑二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide,DMSO）的毒理性質，將DMSO 濃度降為5%后，小鼠存活率顯著提升（存活率為100%）[19]。

表1 不同濃度白消安處理后小鼠的行為狀態 [17]

由于白消安具有骨髓抑制作用，會導致血液中紅細胞、白細胞、血細胞等數量減少，從而導致小鼠因缺血死亡[5]。為此，研究報道，在腹腔注射白消安時，同時注射同源骨髓細胞的方法可以顯著降低小鼠死亡率[20]。張茨等報道了在停藥4周后小鼠體內血象趨于正常，這表明小鼠造血功能已趨于正常[5]；基于此種現象，張茨后又提出睪丸內注射白消安的方法，發現該方法可降低白消安在血液循環中的濃度，顯著提高小鼠給藥后的存活率。

此外，利用白消安來構建小鼠無精子癥模型還面臨著模型差異性的問題，相同劑量的白消安得到最終的死亡率結果也會出現差異[5,15,17,21]。造成這一顯著差異的原因在于部分白消安經腹腔注射進入血液循環后被消耗或被代謝掉，使得白消安濃度低于理論濃度[11]。此外，小鼠個體差異及生長環境的影響也會使模型具有差異性[6]。

1.2 環磷酰胺

環磷酰胺（Cyclophosphamide,CP）是一種光譜抗腫瘤藥，屬周期非特異性藥，與白消安所代表的氮芥的作用機制相同。臨床發現，環磷酰胺會導致男性性腺功能衰退，睪丸縮小及精子減少[22]。伍歡等采用腹腔注射40mg/kg 的環磷酰胺的方法來構建小鼠無精模型，環磷酰胺處理后小鼠睪丸重量顯著降低，睪丸標志酶γ-谷氨酰轉肽酶（γ-glutamyl transpeptidase,γ-GT，調節生精細胞周期）表達量顯著上升，同時乳酸脫氫酶（Lactic Dehydrogenase,LDH，睪丸生精細胞成熟的標志酶之一）表達量較對照組顯著下降[7]。不難發現，小鼠經環磷酰胺處理后其睪丸內大部分生精細胞的成熟過程被阻斷。

1.3 聯合應用博來霉素、依托泊苷及順鉑

BEP（Bleomycin,Etoposide and Cis-platin,BEP）治療，即聯合博來霉素、依托泊苷及順鉑進行治療惡性卵巢生殖細胞及性索間質腫瘤[23]。臨床發現，該方法可以在一定程度上對這兩種疾病起到一定的治療作用，但患者在治療后短時間內會出現少精子癥或無精子癥，這對青少年，尤其是對生育有一定需求的患者來說不利[24]。有研究表明，亞性和慢亞性BEP 治療雖然會導致模型鼠生精功能衰退，但這也只是一定程度上的衰退，未能使其精子發生的功能完全中斷[24]。Marcon 等將試驗鼠長期置于BEP 環境中來驗證該方法是否會對精原干細胞的形成產生影響，調整體重及表面積使其所使用的BEP 劑量等同于臨床上人體所需劑量，結果發現，BEP 處理后其睪丸重量較正常試驗鼠偏低[25]。雖然BEP 處理會降低試驗鼠精原干細胞群落的大小及功能，但這種效應是短暫的，甚至是可以完全恢復[26]。與前兩種方法相比，這種方法穩定性較低，不為大多數學者所重視。

對試驗小鼠施以化療藥物處理后模型效果顯著。腹腔注射30mg/kg 白消安模型最為穩定試驗動物在該濃度下的致死率在倫理上是可以接受的。但為了最大程度上利用試驗動物，盡可能減少浪費，睪丸注射白消安不失為一個比較明智的做法，但該方法較腹腔注射而言較為煩瑣。環磷酰胺作用機制與白消安一致，這里不再贅述。聯合應用博來霉素、依托泊苷及順鉑（BEP）模型穩定性未達到可接受范圍，不被推薦。

2 物理方法

2.1 放射性射線

放射性射線可導致生精細胞凋亡，引起精子衰退，甚至引發無精癥。射線照射后睪丸內部精原干細胞迅速凋亡，而少數精原干細胞則活躍旺盛，以修補損傷系統[27]。輻射對生殖系統的損傷主要是通過產生活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）引起細胞膜脂質過氧化，從而損傷未成熟生殖細胞的DNA 這一途徑來介導的[28]。低劑量照射睪丸即可誘導精原細胞數量減少（0.03Gy）和精原細胞與精母細胞染色體損傷（0.05Gy）。

2.1.1 X 射線

X 射線照射會引起睪丸生精上皮壞死、各級生精細胞排列混亂，組織分析發現有空腔出現及生精小管腔內精子數量急劇下降等現象[29]。徐銳利用8GyX 射線（照射速率2.28Gy/min）對小鼠進行全身照射，照射后小鼠食欲下降，體重減輕，活動減少但并未出現死亡現象[30]。研究表明，西羅莫司靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin,mTOR 蛋白）參與細胞生長、增殖、分化與細胞凋亡自噬，mTORC1 作為其重要組成蛋白，是信號轉導重要靶點[31]。徐銳通過研究證實，X 射線可過度激活mTORC1 信號通路，進而導致生精細胞產生凋亡[30]。劉鳳華等[29]采用不同濃度X 射線局部照射睪丸10min。其結果提示，當X 射線照射劑量達到1400cGy（14Gy）和1600cGy（16Gy）時可使小鼠不育。射線劑量過高則會導致小鼠死亡，過低會導致相應的模型構建失敗。Rowley 等報道，當人體接受200～300cGy 劑量的射線后將導致生精障礙，需30 個月才可以恢復；在400～600cGy 時需要長達5 年的時間才可以恢復；當劑量超過800cGy 時將導致終身不育[32]。

2.1.2 60Co-γ 射線

60Co-γ 射線多用于腫瘤的放射性治療，但由于其常會引起性腺生精功能損傷甚至喪失，亦會導致下丘腦、垂體的損傷，引起體內激素分泌異常。同時，由于60Co-γ 射線的溫和性，多有學者采用60Co-γ 射線來構建無精癥[33,34]。王磊等對小鼠進行全身放射性照射，劑量為4Gy，劑量率為0.55/min，輻射完成后第14 天發現精子活力下降、畸形率升高、生精細胞壞死、生精上皮退化、結構改變、生精小管出現萎縮等現象，且這一癥狀隨時間延長而加重[35]。

2.2 隱睪手術

隱睪癥（Cryptorchidism）是指一側或兩側睪丸未能下降到陰囊而滯留在體內腹腔中，是目前臨床上常見的男性不育癥狀[36]。絕大多數小鼠睪丸處于陰囊中，陰囊中溫度較腹腔低3～8℃不等，為精子發生提供了良好的溫度環境，有助于精子生成[37]。精子對所處環境要求極其苛刻，不當的發育溫度會導致生精細胞凋亡及精子發生障礙[8]。隱睪癥不僅會影響男性生精，同時還增加男性罹患睪丸癌的危險[38]。構建隱睪模型時需在小鼠腹腔外皮開一個約1cm 的切口，而后將肌肉層打開，找到兩側脂肪頭后將其拉出小鼠體內，斷開睪丸引帶后將脂肪頭捆綁在一起，最后依次縫合肌肉層和外皮[39]。此時小鼠睪丸存在于腹腔中，利用這一方法可以構建出隱睪無精模型。隱睪試驗時，睪丸越在腹腔上方，模型構建的越成功。Li 等發現，精子形成在初級精母細胞階段即被阻斷，并驗證了抗氧化藥物白藜蘆醇對恢復精子生成起到了一定的促進作用[3]。Yi 等通過構建隱睪模型發現，隱睪誘導生精細胞發生凋亡與自噬，且凋亡發生在隱睪手術完成后的第3 天[40]，這一研究提示我們是否可以將精子減少機制的研究轉移到細胞自噬與凋亡的相互作用中。探索如何抑制生精細胞的自噬與凋亡或許會為治愈隱睪癥帶來希望。

放射性射線雖然簡單，但高昂的成本使得眾多實驗室無法利用該方法構建模型，而且不當的操作方法可能會導致輻射泄漏而傷害實驗人員，甚至導致男性生殖障礙。成本低廉且簡單易行的隱睪手術不失為一種好的方法，不少實驗室通過構建隱睪模型而獲取了一些重要的實驗成果，發現了幾個重要的與精子發生有關的基因[41-43]。

3 生物方法

將外源基因在體外進行轉染及整合，并將其移植到受體動物細胞中進行表達，此時受體動物稱之為轉基因動物。制作轉基因動物的方法有顯微注射法、反轉錄病毒法、胚胎干細胞法、電脈沖法、精子載體導入法等，其中顯微注射法是制作轉基因動物最成功也是最常用的方法[44]。無精癥實驗中常用的轉基因小鼠是W/Wv 和SL/SLd 突變鼠。W/Wv 和SL/SLd 小鼠是通過使W 和SL 基因出現等位突變，進而影響基因表達的效果[45]。生精細胞受此影響而出現不育現象。二者無精機制不同，其中W/Wv 突變小鼠是因為精原干細胞的清除，而SL/SLd 突變鼠則是由于支持細胞缺陷導致的[46]。已知哺乳動物西羅莫司靶蛋白（mTOR）與精子發生有千絲萬縷的聯系，而Rictor 是其重要組分。因而，董合玲等構建了cKO 敲除鼠（特異性敲除睪丸內支持細胞Rictor 基因），敲除鼠較正常小鼠的睪丸質量與睪丸內生精細胞數量均降低[47]。

由于轉基因小鼠培養條件苛刻，基因表達水平難以預料，而且絕大多數的模型轉基因表達率低，但個別基因又過表達，使得該方法成本昂貴，不為大家所重視。但近幾年發展起來的CRISPR-Cas9 系統使基因編輯(2020 年諾貝爾化學獎頒給了Emmanuelle Charpentier 和Jennifer A，以表彰她們在開發基因組編輯技術中發揮的重要作用) 得到了空前關注[48]，該技術可對靶基因進行特定修飾，有望促進轉基因小鼠技術的研究進展。

4 展望

小鼠無精癥模型在雄性哺乳動物生育障礙研究中扮演重要角色。現雖已證明無精癥的發生與多種因素有關，如藥物、溫度、射線等，但具體機制尚不明確。在構建模型過程中，尋找最佳的實驗條件顯得尤為重要（即使其睪丸內生精細胞完全消失、完全耗盡內源性精子）。近年來，以無精癥模型為基礎開展精子發生機制的研究日益受到人們青睞。同時，通過此模型已幫助研究者篩選到益精效果顯著的藥物，如白藜蘆醇[9]、番茄素[49]等。總體而言（表2），使用化療藥物及隱睪手術構建的無精癥模型穩定性最佳；放射性射線雖簡單但高昂的儀器成本使該方法難以普及；利用精子對溫度的不耐受性雖也可以構建合適的模型，但其不穩定性仍需研究者考慮；轉基因動物方法初顯成效，雖成本昂貴，伴隨著各種新興基因編輯方法，轉基因動物模型必將在模型構建方面前景廣闊。

表2 常用模型制備方法的優缺點比較