初級膽汁酸合成途徑參與左心衰竭大鼠肺動脈高壓的形成*

董 博， 譚蘭蘭， 胡駿豪， 牛 歡， 周 騏， 武曉靜△

（1深圳大學總醫院心血管內科，廣東深圳 518055；2重慶醫科大學第二附屬醫院心血管內科，重慶 400010）

心力衰竭（heart failure，HF）主要由心臟左心系統疾病引起，是高血壓、冠心病和心臟瓣膜病等多種心血管疾病發展的結局。臨床上約60%～70%左心功能不全患者會出現肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH），稱為心力衰竭相關肺動脈高壓（HFPH）［1-2］。已有報道心力衰竭進展過程中伴隨代謝過程的改變［3-4］，改善心肌代謝常常能改善心衰患者的臨床表現和預后［5］。然而，代謝在心力衰竭相關肺動脈高壓形成和發展中的作用尚不清楚。為進一步闡明HF-PH 代謝的變化及調節機制，我們通過復制大鼠主動脈弓縮窄（transverse aortic constriction，TAC）建立HF-PH 模型，探討了PH 形成過程中血清代謝組的變化及可能的代謝途徑。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

1.1 實驗動物 雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（6

周齡）26 只，合格證號為No. 44007200091380，體質量（200±20）g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供并飼喂于重慶醫科大學動物實驗中心IVC 級動物飼養室，健康情況良好。

1.2 主要儀器和試劑 TripleTOF 5600/6600 質譜儀（SCIEX）；1290 Infinity LC 超高效液相色譜（ultraperformance liquid chromatography，UPLC）儀（Agilent）；5430R 低溫高速離心機（Eppendorf）。色譜柱：Water，ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm×100 mm column，Water，ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm，2.1 mm×100 mm column。乙腈（Merck）；乙酸銨（Sigma）。

2 實驗方法

2.1 TAC 模型的制備及分組 6 周齡SD 大鼠20 只行TAC，其中1 只死于術中出血，1 只死于麻醉意外，18 只存活。根據術后不同時間分為0 周、6 周和9 周組（均n=6）；另設假手術（sham）組（n=6），手術過程與手術組相同，但不結扎主動脈弓。TAC 模型的建立［6］：腹腔注射戊巴比妥（60 mg/kg）麻醉后，仰臥位將其固定于37 ℃的加熱墊上。行氣管插管，潮氣量為4～6 mL/200 g，呼吸頻率為70 min-1，呼吸比為1∶1。在手術區域消毒備皮，從左胸部剪開皮膚，鈍性分離胸大肌和胸小肌，暴露出肋骨。在近左胸骨旁第2～3肋間無菌操作下剪開約1.0 cm 水平切口，鈍性分離血管、筋膜，撥開胸腺，暴露主動脈弓。用特殊制備的彎鑷在右無名和左頸總動脈之間挑起主動脈弓穿一根2-0絲線后，在主動脈弓旁邊放置去掉針尖的彎曲的16G 針頭（直徑1.6mm），結扎主動脈后迅速取出針頭，將胸腺放回胸腔。結扎確認無出血后逐層關胸，縫合皮膚。繼續通氣10 min 左右，待大鼠恢復自主呼吸后，拔出氣管插管，放回動物房飼養。術后使用大鼠尾部測量儀測量大鼠心率和血壓。

2.2 超聲心動圖檢測 采用VisualSonics 的VeVo 2100 型高分辨小動物超聲儀，由超聲科具有小動物超聲操作經驗的醫師檢測。將各組檢測大鼠用2%戊巴比妥腹腔注射麻醉后，其四肢固定于泡沫板上，脫去胸前毛發充分暴露胸骨和左胸廓位置，然后行M 型超聲心動圖檢測舒張期室間隔厚度（interventricular septum thickness at diastole，IVSTd）、收縮期室間隔厚度（interventricular septum thickness at systole，IVSTs）、左室舒張末期內徑（left ventricular internal diameter at diastole，LVIDd）、左室收縮末期內徑（left ventricular internal diameter at systole，LVIDs）、左室舒張后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness at diastole，LVPWd）、左室收縮后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness at systole，LVPWs）、左室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左室心肌質量（left ventricular mass，LV mass）和左室舒張末期容積（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）等指標。

2.3 血流動力學的檢測 大鼠經2%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后仰臥固定于操作臺上，暴露右頸外靜脈，結扎遠心端，于近心端作一斜切口，用充盈肝素鹽水的硬膜外麻醉管于結扎點近心端，順血管走向插入1 mL 注射器針頭，沿針頭切口送入右心導管后，將測壓管與壓力換能器連接，從頸外靜脈緩緩送入至上腔靜脈、右心房，連接壓力換能器與三通管，依據計算機屏幕顯示的圖像和波幅變化，判斷導管尖端位置，根據穩定后的壓力波形，測定右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）；導管再繼續往前至肺動脈檢測平均肺動脈壓（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）。

2.4 非靶代謝組學檢測 樣本采集：用采血針從腹主動脈采集5 mL 血液于肝素抗凝管中，室溫靜置30 min 后，2 000 r/min 離心10 min 分離血清血漿，取上清，液氮速凍，-80 ℃保存備用。

樣本預處理：分別取各組樣本100 μL，加入400 μL 預冷的甲醇乙腈溶液（體積比1∶1），渦旋60 s，于-20 ℃放置1 h 沉淀蛋白，14 000×g、4 ℃離心20 min，取上清冷凍干燥。

色譜條件：樣品采用Agilent 1290 Infinity LC UPLC 系統的HILIC 色譜柱進行分離；柱溫25 ℃；流速0.3 mL/min；流動相組成A 為水+25 mmol/L 乙酸銨+25 mmol/L 氨水，B 為乙腈。梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，B 從95%線性變化至65%；7～8 min，B 從65%線性變化至40%；8～9 min，B 維持在40%；9～9.1 min，B 從40%線性變化至95%；9.1～12 min，B維持在95%。

Q-TOF 質譜條件：分別采用電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）正離子和負離子模式進行檢測。樣品經UPLC 分離后用Agilent 6550 質譜儀進行質譜分析。ESI 源條件如下：氣體溫度：250 ℃；干燥氣體流量：16 L/min；霧化器壓強：20 psig；鞘氣體溫度：400 ℃；鞘氣體流量：12 L/min；毛細管電壓：3000 V；噴嘴電壓：0 V；Fragment 電壓：175 V；mass range：50～1 200 m/z；acquisition rate：4 Hz；cycle time：250 ms。

樣本檢測完畢后，采用TripleTOF 6600質譜儀對代謝物進行鑒定，采集QC 樣品的一級、二級譜圖。ESI 源條件如下：Ion Source Gas1（Gas1）：40；Ion Source Gas2（Gas2）：80；Curtain gas（CUR）：30；source temperature： 650 ℃ ； IonSapary Voltage Floating（ISVF）±5 000 V（正負兩種模式）；二級質譜采用information-dependent acquisition（IDA）獲得，并且采用high sensitivity 模式；declustering potential（DP）：±60 V（正負兩種模式）；collision energy：（35±15）eV；IDA 設置如下：exclude isotopes within 4 Da，candidate ions to monitor per cycle：10。

3 統計學處理

Q-TOF數據采集按mass range進行分段，50～300、290～600、590～900和890～1 200，從而擴大二級譜圖的采集率，每個方法每段采集4個重復。將采集的原始數據經ProteoWizard 轉換成.mzXML 格式，然后采用XCMS 程序進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。代謝物結構鑒定采用精確質量數匹配（＜25 ppm）和二級譜圖匹配的方式，檢索實驗室自建數據庫。

將Q-TOFMS 和UPLC-QTOFMS 獲得的數據經Pareto-scaling 預處理后，進行多維統計分析，包括無監督主成分分析（principal component analysis，PCA），有監督偏最小二乘法判別分析（partial leastsquares discrimination analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）。對于多維統計分析變量權重值（variable important in projection，VIP）＞1 的差異代謝物，進一步采用兩獨立樣本t檢驗進行篩選（P＜0.05）。最后，利用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數據庫（https：//www. genome. jp/kegg/）對差異代謝物進行代謝通路富集分析，對篩選代謝物進行受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析，計算ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）以及模型敏感性和特異性。

使用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差（mean±SD）表示。組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 左心衰竭相關肺動脈高壓模型的建立

與假手術組相比，主動脈弓縮窄0 周鼠尾動脈壓、心率、體重、左室大小和功能等參數均無明顯差異。與0 周組相比，術后6 周和9 周鼠尾動脈壓增高。心臟超聲提示，與0 周組相比，術后6 周和9 周LV mass 和LVPW 均增高，6 周時LVEF 與0 周組相比差異無統計學顯著性，9 周組LVEF 顯著降低（表1）。血流動力學檢測提示，與0周組相比，術后6周mPAP增高，但仍在正常范圍之內［（19.53±0.97）mmHgvs（15.81±0.78）mmHg，n=6，P＜0.05］，術后9 周mPAP 增高［（30.08±1.07）vs（15.81±0.78）mmHg，n=6，P＜0.01），見圖1A。術后6 周和9 周RVSP 均增高，見圖1B。結合心臟超聲和血流動力學結果，TAC術后6 周已出現左室重構，肺動脈壓力開始升高，術后9 周進展為HF-PH，提示TAC 術后6 周到9 周為肺動脈高壓形成和發展階段。

表1 TAC術后左心結構和功能變化Table 1. The structure and function changes of left heart after TAC surgery（Mean±SD.n=6）

Figure 1. Changes of mPAP and RVSP after TAC surgery. Mean±SD.n=6.*P＜0.05vs 0-week group；?P＜0.05vs 6-week group.圖1 TAC對平均肺動脈壓和右室收縮壓的影響

2 代謝模式分析

我們進一步分析了TAC 術后6 周和9 周的代謝分布模式。TAC 術后9 周組和6 周組樣本在正負離子模式下TIC 比較結果顯示各色譜峰的響應強度和保留時間基本重疊，說明在整個實驗過程中儀器誤差引起的變異較小；進一步行OPLS-DA 分析代謝物的二維分布模式，在POS 和NEG 模式下，9 周組與6周組相比代謝模式均明顯分離，POS 模式下R2 和Q2 分別為0.805 和0.356；NEG 模式下R2 和Q2 分別為0.994 和0.446。結果提示數據擬合、重復性好，模型穩定有效，心衰發展為肺動脈高壓過程中代謝模式發生顯著變化，見圖2。

Figure 2. OPLS-DA analysis of metabolites by a solvent system under positive and negative ion modes. A：score plot under positive ion mode；B：score plot under negative ion mode；C：permutation test under positive ion mode；D：permutation test under negative ion mode。圖2 OPLS-DA分析代謝物分布模式

3 差異代謝物

我們進一步分析了TAC 術后9 周組和6 周組的差異代謝物。根據由OPLS-DA模型獲得的特征變量VIP 值，篩選出VIP＞1 且P＜0.05 的差異代謝物，我們發現與6周組相比，9周時差異明顯的代謝物有16個（表2 及圖3），涉及類固醇及衍生物（cholic acid 和chenodeoxycholate）、胺類（triethanolamine）、有機酸（urea 和L-pyroglutamic acid）和脂肪酸（L-palmitoylcarnitine）等。

Figure 3. The clustering results of hierarchical cluster analysis based on the significantly different metabolites between 6-week（6w）and 9-week（9w）groups after TAC surgery under positive and negative models.圖3 TAC術后6周和9周組差異代謝物的聚類分析

表2 TAC術后9周和6周組相比差異代謝物Table 2. Identified significantly different metabolites between 9-week and 6-week groups

我們分析了9 周與6 周組相比代謝通路的變化，發現可能參與肺動脈高壓形成的代謝通路有aminoacyl-tRNA biosynthesis、ABC transporters、arginine biosynthesis、valine，leucine and isoleucine biosynthesis、pantothenate and CoA biosynthesis、phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis、mTOR signaling pathway、vitamin digestion and absorption、valine，leucine and isoleucine degradation 和primary bile acid biosynthesis，其中與初級膽汁酸合成相關的代謝物有膽酸和鵝脫氧膽酸，見表3。

表3 KEGG富集代謝通路Table 3. KEGG enrichment pathway analysis

5 ROC曲線分析

我們進一步分析了初級膽汁酸合成代謝通路相關代謝物膽酸和鵝脫氧膽酸預測HF-PH 的價值，ROC 分析兩者預測肺動脈高壓的AUC 分別為和0.929和0.905，見圖4。

Figure 4. ROC analysis of cholic acid and chenodeoxycholate in predicting PH-HF. A：ROC for cholic acid；B：ROC for chenodeoxycholate.圖4 ROC分析初級膽汁酸合成通路代謝物預測心力衰竭并發肺動脈高壓的價值

討論

肺動脈高壓是左心衰竭的常見并發癥，心力衰竭常伴能量代謝改變，本研究中我們通過TAC 建立左心衰竭相關肺動脈高壓模型，通過非靶代謝組學等方法研究了心力衰竭發展過程中與肺血流動力學和肺動脈高壓形成相關的代謝物和代謝通路。我們發現TAC 術后6 周mPAP 開始升高，9 周時出現HFPH，在PH 形成和發展過程中，代謝模式和代謝物發生顯著改變，膽汁酸合成可能參與了HF-PH 形成和發展的過程。

根據WHO 分類，肺動脈高壓分為五大類，其中由左心疾病引起的肺動脈高壓屬于第二大類。左心疾病中，心力衰竭是引起肺動脈高壓最常見的病因［1-2］。與特發性肺動脈高壓不同，通常認為血流動力學異常是左心疾病導致HF-PH 的重要初始因素。左心功能衰竭時左室和左房負荷增高，增高的左心負荷逆向傳遞使肺靜脈壓升高、肺泡毛細血管床屏障破壞，肺血管內壓力持續升高會引起肺小動脈收縮及肺血管重構，形成肺動脈高壓［7］。本研究中我們通過TAC 建立左心壓力超負荷模型，發現TAC 術后6 周LV mass 和LVPW 均增高，mPAP 開始升高但仍在正常范圍；9 周時LVEF 降低，mPAP 顯著升高，形成HF-PH，提示6～9 周是HF-PH 形成和發展的過程。

雖然HF-PH 由心力衰竭引起，但基于心臟重構的治療和血管活性藥物的應用并不能完全有效改善肺血流動力學［8］。目前對心力衰竭引起肺血管重構的機制尚缺乏深入研究。由于心力衰竭而常伴能量代謝改變，本研究中我們分析了肺動脈高壓形成過程中血清代謝組學變化，發現TAC 術后9周與6周相比，血清代謝模式發生顯著改變，根據VIP＞1 且P＜0.05 的標準篩選出16 個差異代謝物，涉及類固醇及衍生物、胺類、有機酸、脂肪酸等。進一步KEGG 分析提示多條代謝相關通路發生變化，膽汁酸合成是變化顯著的代謝通路之一，與膽汁酸合成途徑相關的代謝物有膽酸和鵝脫氧膽酸。

膽汁酸在體內最重要的生理功能是幫助脂類物質的消化和吸收，可分為初級膽汁酸和次級膽汁酸。初級膽汁酸通常以膽固醇為主要原料在肝細胞合成，主要包括膽酸和鵝去氧膽酸，是膽汁酸合成途徑的直接產物。初級膽汁酸在腸道細菌作用下第7 位α羥基脫氧轉化為次級膽汁酸，包括脫氧膽酸和石膽酸等。合成膽汁酸是膽固醇在人體內的主要代謝方式，約99%膽固醇隨膽汁經腸道排出體外。然而，隨著對膽汁酸作用的深入認識，近年發現其不僅參與脂代謝，還是屬于信號分子，參與消化以外多種生理、病理功能的調節［9］。Zhao等［10］分析了8例特發性肺動脈高壓（IPAH）患者的肺組織標本，非靶代謝組研究發現與對照組正常肺組織相比，IPAH 患者肺組織多種膽汁酸代謝物增高，包括牛磺膽酸、甘氨膽酸、牛磺鵝膽酸鹽等，進一步基因芯片和RNA 及蛋白水平研究發現肺組織細胞色素P450B1（CYP7B1）高表達，他們的研究提示除肝組織外，肺組織可能也具有從頭合成膽汁酸的作用，而膽汁酸代謝可能參與了IPAH的發展。

膽汁酸是核受體法尼酯衍生物X 受體（famesoid X receptor，FXR）的天然配體。而FXR 通常在肝、腎和胃腸道等器官高表達，在非經典膽汁酸靶組織如肺和血管中亦有表達，在人呼吸道上皮細胞、肺血管內皮細胞及平滑肌細胞中均能檢測到FXR。膽汁酸和FXR 結合后可直接參與多種基因調控，包括編碼調控脂質、葡萄糖、能量代謝穩態以及炎癥和纖維化等蛋白質的基因。FXR 活化能夠抑制炎癥反應并促進肺損傷后的肺修復［11］。Vignozzi 等［12］和Comeglio等［13］通過野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓模型，發現FXR 受體激動劑奧貝膽酸治療能顯著改善肺動脈高壓大鼠的運動耐量和肺血管重構，提示膽汁酸代謝的心肺保護作用。本研究中我們通過TAC 建立左心壓力超負荷大鼠心衰模型，發現膽汁酸代謝可能還參與了HF-PH 的發展，與6 周組相比，TAC 術后9 周時血清膽酸增加4.16 倍，鵝脫氧膽酸增加3.67 倍；同時，ROC 分析提示膽酸和鵝脫氧膽酸預測心力衰竭并發肺動脈高壓的AUC 分別為0.929 和0.905。結合膽汁酸激活FXR受體通路發揮抗炎和抗纖維化的作用，我們的研究提示膽汁酸代謝在HF-PH 中可能也發揮保護作用，血清膽酸和鵝脫氧膽酸可能成為預測心衰并發肺動脈高壓的血清標志物。

膽汁酸的代謝需在腸道微生物的作用下完成，因此膽汁酸與腸道微生物之間存在動態的相互作用。而腸道菌群和腸道微生物在心血管疾病中的作用逐漸引起關注［14］，近年認為肺動脈高壓是個系統性疾病，多項研究表明肺動脈高壓時腸道微生物的分類和功能均發生改變［15-16］。膽汁酸通過與腸道微生物群和FXR 受體的相互作用參與調節機體代謝、免疫、炎癥以及纖維化等過程，我們的結果提示腸道菌群可能也參與了HF-PH 的形成和發展，以膽汁酸受體及腸道微生物為靶點的治療，可能為臨床上HFPH的干預提供新方法。

綜上所述，代謝組學通過檢測靶向代謝物，通常能為疾病的發生機制、疾病嚴重程度、疾病進展和潛在治療方法提供新線索。本研究中我們發現初級膽汁酸合成途徑可能參與了HF-PH的形成，可能成為預測早期肺動脈高壓的標志物。本研究主要來源于動物實驗，存在一定局限性，初級膽汁酸合成途徑與臨床病例的相關性和臨床意義尚待進一步驗證。我們的研究為HF-PH的早期識別和治療提供新思路。