FFAR4基因多態性與藏族先天性心臟病關系的研究*

李爽林， 張 輝， 王 洋， 高 慧， 楊應忠， 劉永年

（青海大學醫學院，青海西寧 810001）

先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）的發病機制中遺傳因素占重要作用［1］，主要包括染色體異常、單基因病和多基因病等。流行病學數據顯示，高原地區CHD 發病率明顯高于平原地區且具有民族差異［2］。本課題組前期利用Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片對部分高原藏族CHD患者單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點進行全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS），發現易感位點rs11187529 存在于游離脂肪酸受體4（free fatty acid receptor 4，FFAR4）基因上。FFAR4 是一種G 蛋白偶聯受體，在找不到配體以前被稱為G 蛋白偶聯受體120（G-protein-coupled receptor 120，GPR120）［3］，作用于長鏈脂肪酸包括以二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosexaenoic acid，DHA）為代表的ω3 多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）家族［4］。研究顯示，FFAR4 在大鼠心臟組織中存在表達，高脂飲食可明顯上調心臟組織中的FFAR4基因轉錄物［5］。后期研究進一步表明，FFAR4 在小鼠的心肌細胞和成纖維細胞中表達，且可通過信號傳導介導EPA 而防止心臟成纖維細胞的纖維化［6］。本研究選擇了前期研究新發現的易感位點所在基因FFAR4，進一步驗證FFAR4基因多態性與藏族CHD的關系。

材 料 和 方 法

1 研究對象

選取2018 年9 月～2019 年9 月在青海大學附屬醫院、青海省人民醫院等就診的藏族CHD 患者103例，同期參加體檢的藏族健康對照者267 例。病例組納入標準均經病史資料采集，臨床體格檢查診斷，心電圖、心臟彩超檢查或經心導管及心血管造影檢查后臨床確診為CHD，所有病例組CHD 患者排除無其他先天性遺傳疾病。同期參加體檢的年齡、性別相匹配的健康藏族對照者，經病史資料采集，臨床體格檢查診斷，心電圖和心臟彩超檢查證實為健康者，所有健康對照者均排除CHD 和其他先天性遺傳疾病。本研究通過青海大學醫學院倫理委員會的審批，經研究對象同意并簽署知情同意書。

2 候選tag SNP位點的篩選

研究表明，部分SNP 位點可提供遺傳單位單體型（haplotype）內大部分信息，這些位點稱為標簽SNP（tag SNP）。通過千人數據庫中基因數據庫查找FFAR4基因的常見SNP 位點，使用HaploView 4.2 軟件通過連鎖不平衡（linkage disequilibrium）分析挑選tag SNP 位點，設置參數最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.05，重新篩選SNP 位點后，根據SNP 之間連鎖不平衡相關程度R2＞0.08 選擇tag SNP，單體型塊的劃分采用表示位點間連鎖不平衡程度的D值置信區間（confidence interval，CI）法，D值的95%CI在0.70～0.98 的相鄰SNP 歸于同一個單體型塊，根據篩選結果選擇了5 個tag SNP 位點，即rs12219199、rs12220062、rs77999136、rs12243124 和rs10882282，見圖1及表1。

表1 候選tag SNP位點信息表Table 1. Information about candidate tag SNP loci

Figure 1. Selection of candidate tag SNP loci. The black triangle box in the figure represents the enclosed monomer block，the red panel shows that there is a strong linkage balance between adjacent SNPs，and the white panel indicates that the linkage disequilibrium is weak or non-existent.圖1 候選tag SNP位點的篩選

3 實驗方法

3.1 基因提取 使用用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管采集CHD 患者和健康對照者外周靜脈血5 mL，1 788.8×g離心10 min 后吸取血漿層至凍存管，置冰箱保存（-80 ℃）；提取白細胞層至15 mL 的離心管中，加入紅細胞裂解液至12 mL，混勻后1 788.8×g離心10 min 倒掉紅細胞層，重復上述步驟充分去除紅細胞，最后加入1.5 mL白細胞裂解液室溫保存。

使用Gentra Puregene Blood Kit（Qiagen）按照標準步驟提取基因組DNA，提取后的DNA 經瓊脂糖凝膠（1.5%～2.0%）電泳40 min 后，在凝膠成像曝光儀中觀察提取的DNA 結果。從全部研究對象的血液標本中提取了基因組DNA 后，使用核酸定量分析儀測定其濃度和純度，DNA純度結果均在1.8＜A260/A280＜2.0，代表純度高符合使用要求，濃度稀釋至50 μg/L后凍存于冰箱（-20 ℃）備用，見圖2。

Figure 2. Image of agarose gel electrophoresis of some DNA.The PCR products were exposed by gel imaging system，and the results showed that the bands were clear and bright，without heterobands and tails，indicating that the extracted DNA was in ideal condition.圖2 部分DNA樣本瓊脂糖凝膠電泳圖

3.2 引物設計 采用Genotyping Tools 及MassARRAY Assay Design 軟件（Agena）為每個候選tag SNP位點自動設計PCR 擴增引物及單堿基延伸引物，由北京博奧晶典生物技術有限公司合成，序列見表2。

表2 候選tag SNP位點的引物序列Table 2. The sequences of the primers for candidate tag SNP loci

3.3 PCR 擴增 將反應體系［DNA 1 μL 和反應混合物4 μL（HotStarTaq DNA 聚合酶0.1 μL，引物1 μL，dNTPs 0.1 μL，緩沖液0.5 μL，MgCl20.4 μL，滅菌雙蒸水1.9 μL 補齊）］共5 μL 加至384 孔PCR 反應板中。在PCR 擴增儀上將設置反應條件為：94 ℃預變性4 min，循環1 次；94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環45次；72 ℃復延伸。

3.4 PCR 產物的蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）處理 在PCR 產物中加入SAP 處理以去除擴增產物中剩余的、非結合的dNTPs，SAP通過切斷5'端的磷酸基，使未結合的DNA 磷酸化。將反應體系［PCR 產物5 μL 和SAP 混合液2 μL（包括SAP 0.5 U 和緩沖液0.17 μL）］共7 μL分配到384孔PCR 反應板的每個孔中。將處理過的培養板放置在37 ℃的培養箱中40 min，然后再放置在85 ℃的培養箱中5 min（反應條件為：37 ℃預變性40 min；85 ℃變性5 min；4 ℃復延伸），以使SAP失活。

3.5 單堿基延伸反應 反應體系（9 μL）包含SAP處理后PCR 產物7 μL 和延伸反應混合物2 μL（引物0.94 μL，iPLEX 酶0.041 μL，iPLEX 緩沖液0.2 μL，iPLEX 終止液0.2 μL，滅菌雙蒸水0.619 μL 補齊），加入到PCR 反應孔上。將反應程序設置為：94 ℃預變性30 s，循環1 次；52 ℃變性5 s，80 ℃退火5 s，循環4 次；94 ℃預變性5 s，循環1 次；52 ℃變性5 s，80 ℃退火5 s，循環39次；延伸3 min，4 ℃維持。

3.6 樹脂純化 這一清理步驟對于優化延長反應產物的質譜分析非常重要。將6 mg Clean Resin樹脂平鋪到樹脂板中，在單堿基延伸反應的產物對應孔內加入16 μL的水，將干燥后的樹脂添加到引物擴增反應產物中，使樹脂與反應物充分接觸，離心使樹脂沉入孔底部。經過酸性試劑預處理的陽離子樹脂，去除Na+、K+和Mg2+等鹽類，如果不去除，這些離子會在質譜中產生高背景噪聲。

3.7 芯片點樣 通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術，檢測延伸產物分子量的大小，將SNP 引起的堿基差異通過分子量的差異而體現。將樹脂純化后的延伸產物移至芯片上，將芯片放入質譜計中，然后用真空下的激光通過基質輔助激光解吸電離飛行時間方法對每個點進行拍攝，在MALDI-TOF 質譜中，激光束作為解吸和電離源，基質吸收了激光的光能，并導致部分被照亮的基質汽化，迅速膨脹的基質羽狀物將一些分析物帶入真空中，基質分子吸收大部分入射激光能量，使樣品分子被汽化和電離，它們就被靜電轉移到飛行時間質譜儀（time-of-flight mass spectrometer，TOF-MS）中，在那里它們從基質離子中分離出來，根據它們的質量-電荷比（m/z）單獨檢測，檢測結果使用TYPER 4.0軟件（Agena）進行基因分型。

4 統計學處理

數據分析采用SPSS 19.0 軟件。計量資料采用均數±標準差（mean±SD）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料兩組間比較采用χ2檢驗。使用Hardy-Weinberg 平衡檢驗樣本的群體代表性，以P＞0.05 代表樣本基因型符合遺傳平衡，具有群體代表性。兩組間基因型和等位基因頻率的比較使用χ2檢驗或Fisher 精確概率檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。連鎖不平衡和單體型通過SHEsis（http：//analysis.bio-x.cn）在線網站分析，分析結果使用P值、優勢比（odds ratio，OR）及其95%CI 表示，以P＜0.05為差異有統計學意義，OR=1表示該因素對疾病的發生不起作用，OR＞1表示該因素可能為危險因素，OR＜1表示該因素可能為保護因素。

結果

1 病例組和對照組一般資料比較

樣本資料包括CHD 患者103 例和健康對照者267例，病例組平均年齡為（22.0±17.0）歲，對照組為（22.2±12.3）歲，組間年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。病例組男性42例，女性61例，對照組男性99例，女性168 例，χ2檢驗分析結果顯示組間性別構成差異無統計學意義（P＞0.05）。

2 Hardy-Weinberg平衡檢驗結果

使用Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗Excel 小軟件在線檢驗樣本的基因多態性是否符合遺傳平衡。結果顯示，FFAR4基因篩選的5 個候選tag SNP 位點rs12219199、rs12220062、rs77999136、rs12243124 和rs10882282 在病例組和對照組均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（P＞0.05），所選位點具有樣本代表性，可進行下一步分析，見表3。

表3 候選tag SNP位點的Hardy-Weinberg平衡檢驗Table 3. Hardy-Weinberg equilibrium test for candidate tag SNP loci

3 候選tag SNP位點基因型和等位基因型頻率分析

FFAR4基因SNP分型結果如表4所示，rs1221919的3 種基因型CC、CT 和TT 在病例組分別是51.5%、36.9%和11.7%，在對照組分別是50.2%、42.7%和7.1%，CT 和TT 基因型頻率分布在兩組間無顯著差異（P＞0.05）；等位基因C 和T 在病例組分別是66.9%和30.1%，在對照組分別是71.5%和28.5%，兩組間T 等位基因頻率分布無顯著差異（P＞0.05）。rs1220062的3種基因型GG、GA 和AA 在病例組分別是46.6%、38.8% 和14.6%，在對照組分別是51.3%、38.6%和10.1%，GA 和AA 基因型頻率分布在兩組間無顯著差異（P＞0.05）；等位基因G 和A 在病例組分別是66.0%和34.0%，在對照組分別是70.6%和29.4%，兩組間A 等位基因頻率分布無顯著差異（P＞0.05）。rs77999136 的3 種基因型CC、CT和TT在病例組分別是89.3%、9.7%和1.0%，在對照組分別是90.6%、9.4%和0.0%，CT 和TT 基因型頻率分布在兩組間無顯著差異（P＞0.05）；等位基因C和T 在病例組分別是94.2%和5.8%，在對照組分別是95.3%和4.7%，兩組間T 等位基因頻率分布無顯著差異（P＞0.05）。rs12243124 的3 種基因型TT、TC和CC 在病例組分別是33.0%、7.6%和19.4%，在對照組分別是33.7%、51.3%和15.0%，TC 和CC 基因型頻率分布在兩組間無顯著差異（P＞0.05）；等位基因T和C在病例組分別是56.8%和43.2%，在對照組分別是59.4%和40.6%，兩組間C 等位基因頻率分布無顯著差異（P＞0.05）。rs10882282 的3 種基因型GG、GC 和CC 在病例組分別是26.2%、46.6% 和27.2%，在對照組分別是30.7%、51.3%和18.0%，GC 和CC 基因型頻率分布在兩組間無顯著差異（P＞0.05）；等位基因T 和C 在病例組分別是68.0%和32.0%，在對照組分別是68.7%和31.3%，兩組間C等位基因頻率分布有顯著差異（P＜0.05）。

表4 候選tag SNP位點在CHD組和健康對照組中基因型及等位基因頻率的分布Table 4. Distribution of the genotypic and allelic frequencies of the candidate tag SNP loci between congenital heart disease（CHD）group and healthy control group

4FFAR4 基因候選tag SNP 位點的連鎖不平衡和單體型分析結果

候選tag SNP 位點按rs12219199-rs12220062-rs-77999136-rs12243124-rs10882282在染色體上的先后順序進行排序，這些SNP位點間的遺傳連鎖程度以D值表示，FFAR4基因非編碼區候選tag SNP 位點連不平衡圖顯示，這些SNP位點之間存在較強的連鎖不平衡，見圖3。

單體型分析結果顯示有7 類常見單體型，其中單體型CACCC 在兩組間無顯著差異（P＞0.05），OR=1.463（95% CI：0.915～2.340）；單體型CGCCC 在兩組間無顯著差異（P＞0.05），OR=0.918（95% CI：0.445～1.896）；單體型CGCTC 在兩組間有顯著差異（P＜0.05），OR=2.849（95%CI：1.400～5.798），可能為CHD 的危險因素；單體型CGCTG 在兩組間有顯著差異（P＜0.05），OR=0.702（95%CI：0.506～0.974），可能為CHD 的保護因素；單體型TACCC 在兩組間無顯著差異（P＞0.05），OR=1.054（95% CI：0.695～1.598）；單體型TGCCC 在兩組間無顯著差異（P＞0.05），OR=0.640（95% CI：0.281～1.457）；單體型TGTTG 在兩組間無顯著差異（P＞0.05），OR=1.223（95%CI：0.586～2.549），見表5。

表5FFAR4基因非編碼區單體型分析Table 5. Haplotype analysis of noncoding area of theFFAR4 gene

討論

CHD 是國內外新生兒發病率最高的先天性出生缺陷，占所有先天性畸形的25%［8］，也是圍產期和嬰兒死亡的主要原因［9］，在活產新生兒中CHD 的發病率約為0.8%～0.9%，死產或流產胎兒中的發病率達1%［10］。CHD 的確切發病機制目前仍沒有完全闡明，研究表明遺傳因素和環境因素的相互作用是其主要的致病危險因素［11］。流行病學統計調查顯示高原地區的CHD 發病率較平原地區升高，且發病率與海拔高度成正相關［12］，海拔4 000 米以上的藏族兒童患病率0.874%［13］，明顯高于國內低海拔地區［14-15］，且患病率在不同民族存在差異性，青海省黃南洲兒童CHD在藏族患病率高于漢族［16］，可能與長期生活環境引起的遺傳差異有關。

FFAR4基因位于人類第10 號染色體上，最初是從人類基因數據庫的DNA 片段中克隆所認識，被命名為GPR120；隨著研究發展揭示了其可以作為長鏈脂肪酸的受體，重新命名為FFAR4基因［17］。研究發現，FFAR4基因有兩個受體序列，既可以形成對應BC-101175 受體序列，編碼361 個氨基酸蛋白質的包含1 086 個核苷酸的短轉錄物，稱為FFAR4短序列（FFAR4-S）［18］，也可以交替剪接形成對應NM-181745受體序列，包含361 個氨基酸的蛋白質FFAR4-S 和含有一個額外外顯子3 的377 個氨基酸（包含1 134個核苷酸）的獨特較長同工型，稱為FFAR4長序列（FFAR4-L）［19］。FFAR4-L 中編碼的額外16 個氨基酸間隙，位于FFAR4-L 異構體的第3 個細胞內環，這是一個對G 蛋白偶聯以及拮抗劑誘導的受體磷酸化和隨后的脫敏都至關重要的受體結構域［20］。這個額外的間隙含有4 個磷酸不穩定的絲氨酸/蘇氨酸殘基，在沒有激動劑的情況下，較短的變異體表現出更明顯的基礎磷酸化，表明FFAR4-S 和FFAR4-L 可能具有不同的激動劑刺激的磷酸化譜，FFAR4-L 中的額外間隙可能有助于掩蓋結構性磷酸化位點［21］。至今的研究表明，小鼠和大鼠中只存在FFAR4-S 序列［22］，且非人靈長類動物恒河猴和食蟹猴研究模型顯示，同樣只存在較短的361 個氨基酸蛋白質的受體序列，與人類FFAR4-S 的同源性為97.5%［23］，FFAR4-L序列只存在于人類。因此，人類FFAR4基因的分子研究具有特異性。

Figure 3. Linkage disequilibrium among the 5 candidate SNP loci ofFFAR4 gene. The sequencing of SNP loci is in the order of chromosome position from small to large，and the degree of genetic linkage between these SNPs is estimated asD values. The red panel indicates that there is a strong linkage balance between adjacent SNPs，while the white panel indicates that the connection imbalance is weak.圖3FFAR4基因5個候選tag SNP位點的連鎖不平衡圖

研究表明，FFAR4 通過介導受體EPA，抑制轉化生長因子β1 誘導的小鼠心臟成纖維細胞纖維化，從而預防心力衰竭［24］，且不會在心肌細胞或成纖維細胞中積累［25］。FFAR4 的小分子激動劑GW9508 以濃度依賴的方式在心臟成纖維細胞中阻止了轉化生長因子β1 促纖維化信號傳導，敲除FFAR4后GW9508的抗纖維化作用被阻斷，間接證明了FFAR4 在心臟保護中的介導作用［26］。FFAR4 與ω3 PUFAs 的多種作用相一致。ω3 PUFAs 的有益作用首次被認識到是當時流行病學顯示的富含ω3 PUFAs 飲食人群的心肌梗死發生率較低，隨后幾項大規模隨機臨床試驗證明了ω3 PUFAs 對心臟的保護作用。許多動物研究也表明，ω3 PUFAs 對心血管系統具有多效有益作用，包括抗心律失常、降低血漿甘油三酯、抗血栓形成、抗動脈粥樣硬化、抗炎和抗纖維化作用［27］。多個研究結果表明，ω3 PUFAs 在包括缺血再灌注［28］、心力衰竭［29］和心律失常［30］在內的多種病理生理情況下具有心臟保護作用。其中EPA 的心臟保護作用是最明顯的［31］。EPA 的增加可減少線粒體基質的氧化應激，通過保護線粒體極大地保護了心臟［32］。內源性生成的ω3 脂肪酸脂可通過激活FFAR4 形成ω3 PUFAs-FFAR4通路，減輕血管炎癥［33］、動脈血栓形成和血管內膜增生［34］，從而發揮有益的心臟保護作用。FFAR4與心臟的直接作用機制目前研究較少。

本研究提取了無血緣關系的100 例藏族CHD 患者和100 例藏族健康對照者的基因組DNA 信息，篩選了FFAR4基因非編碼區的5 個tag SNP 位點，通過分析基因型和等位基因型頻率在CHD 病例組和健康對照組的分布差異發現，rs10882282的等位基因C在兩組間的差異有統計學意義，提示rs10882282 位點的等位基因C與藏族CHD 相關。在多因素復雜疾病CHD 中，多個變異位點組合構成的單體型分析同樣具有重要的意義。連鎖不平衡分析顯示，篩選的5個候選tag SNP 位點之間存在連鎖不平衡。單體型分析結果顯示，常見單體型CGCTC 在兩組間的頻率有顯著差異（P＜0.05），OR=2.849（95% CI：1.400～5.798）表明CGCTC 可能為CHD 的危險因素；單體型CGCTG 也與CHD 顯著相關（P＜0.05），OR=0.702（95% CI：0.506～0.974）表明CGCTG 可能為CHD 的保護因素。單體型CGCTG 這幾個基因型均為FFAR4基因的野生基因型，提示FFAR4基因突變后可能導致CHD 的發病，且單體型CGCTG 中易感等位基因G 突變為等位基因C 后，單體型CGCTC 即變成了CHD 的危險因素，再次表明FFAR4基因中攜帶等位基因C 可能是藏族CHD 的致病因素，FFAR4可能為藏族CHD的易感基因。

明確CHD 的遺傳病因對疾病的預防和預后非常重要，早發現、早診斷是治療CHD的關鍵。FFAR4基因多態性與CHD 的研究之前并未開展，本課題首次選擇人類FFAR4基因多態性與高原藏族CHD 的關系研究進行驗證，結果提示FFAR4有可能是CHD的易感基因。不過本研究樣本量有限，存在一定局限性，有待進一步進行深入研究。