基于腸道菌群探討電針對APP/PS1小鼠認知能力的改善機制*

廖冬梅， 龐 芳， 楊云昊， 夏青倩， 李 怡， 郭 嘯， 唐成林△

（重慶醫科大學 1中醫藥學院，2基礎醫學院，重慶 400016）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種年齡相關的，進行性發展的神經退行性疾病，主要表現為記憶學習能力減退，執行功能障礙及焦慮抑郁等神經精神癥狀［1-2］。隨著對AD 發病機制的深入，研究表明該病可能是一種慢性中樞神經系統炎癥反應性疾病，神經炎癥反應處于該病病理過程的中心位置［3-6］。研究顯示，AD 小鼠存在腸道菌群的改變和腸源性炎癥反應，通過神經、內分泌和免疫等途徑，腸道菌群可以調控其腦部的淀粉樣變性和神經炎癥反應［7-10］。通過調控腸道菌群的組成，恢復腸道微生態環境的平衡，抑制腸源性炎癥反應以減輕中樞神經炎癥反應也是目前緩解AD 的途徑之一。研究表明，電針可以調控AD 小鼠的中樞神經炎癥反應，改善其認知功能［11-12］。然而其改善AD 小鼠認知能力的作用與腸道菌群間的關系尚不明確，故本實驗采用電針干預APP/PS1小鼠，觀察其對小鼠結腸組織中核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）、結腸組織及血清中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 含量及腸道菌群的影響，探討電針改善AD 小鼠認知能力的可能機制。

材 料 與 方 法

1 實驗動物與分組

14 只SPF 級5 月齡雄性APP/PS1雙轉基因小鼠及7 只同月齡雄性C57BL/6 小鼠，體質量（29±3）g，均購于南京君科生物工程有限公司，許可證號為SCXK（蘇）2017-0003。代養于恒溫恒濕、12 h/12 h明暗交替、自由攝取食物和水的重慶醫科大學IVC 級動物房內。適應性喂養1周后，將APP/PS1小鼠隨機分為模型（model）組和電針（electroacupuncture，EA）組，以C57BL/6 小鼠作為對照（control）組，每組7 只。所有動物在實驗操作中的處理均符合重慶醫科大學實驗動物倫理委員會規定。

2 主要試劑及儀器

華龍牌針灸針（0.17 mm×7 mm，北京大名科技有限公司）；6805-AⅡ電針治療儀（廣州佳譽醫療器械有限公司）。NLRP3 抗體（Novus）；β-actin 抗體（Affinity）；小鼠TNF-α、IL-1β 和IL-18 酶聯免疫分析試劑盒（江蘇晶美）；Morris 水迷宮（重慶醫科大學藥學院提供）；SMART 3.0 視頻跟蹤平臺軟件（HARVARD APPARATUS）。

3 干預方法

電針組：將小鼠俯臥位固定于解剖板上，選取“百會”、“大腸俞”和“足三里”穴交替進行電針干預，選穴參考《實驗針灸學》［13］。“百會”、單側“大腸腧”為一組，對側“大腸俞”及同側“足三里”為一組，“足三里”隔日交替使用，同側腧穴分別連接電針儀一對正負極，連續波，頻率2 Hz，電流強度1.0 mA，于上午9點開始干預，每日1 次，每次15 min，1 周5 次，連續5周。模型組和對照組小鼠給予相同的抓取操作，不做其他處理。

4 檢測方法及觀測指標

4.1 小鼠糞便收集及檢測 干預結束后，于超凈臺上，采用腹部逼迫法收集小鼠新鮮糞便于無菌凍存管中，每次收集完成后立即將糞便樣本放入液氮中，隨后放入-80 ℃冰箱儲存。樣品16S rDNA 檢測由上海中科新生命生物科技有限公司完成。采用CTAB法對小鼠糞便樣本的總基因DNA 進行提取，并通過1%的瓊脂凝膠對DNA 的純度和濃度進行檢測。根據測序區域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物和高保真DNA 聚合酶對選定的V3-V4 可變區進行PCR擴增。PCR 產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對目標片段切膠回收。根據電泳檢測結果，進行PCR 擴增，回收產物后用QuantiFluor?-ST 藍色熒光定量系統進行定量檢測，根據相應樣本的測序量要求，按不同比例混合。使用NEBNext＆amp;reg；Ultra ?DNA Library Prep Kit 建庫試劑盒構建文庫，并通過Agilent Bioanalyzer 2100 和Qubit進行質檢，質檢合格后上機測序；對測序的有效數據進行OTUs 聚類和物種分類，基于OTU 的結果，使用STAMP 分析各組間菌屬的豐度，獲得顯著性差異菌屬；使用QIIME 計算α 多樣性指數包括Shannon、Chao1 和Goods_coverage 指數，并繪制Shannon 曲線；運用R 包進行PCOA 分析并繪圖。

4.2 Morris水迷宮 5周干預結束后，采用Morris水迷宮評估各組小鼠的認知能力［14］。按照東西南北四個方向將水池均分為4 個象限（SW、NW、NE 和SE），每個象限池壁上均貼有顏色形狀區別明顯的標記物，實驗過程中標記物的位置固定不變，池壁外周懸掛簾布以減小實驗人員的干擾。實驗時在NE 象限放置一個圓柱形的平臺（直徑6 cm，高14 cm），并將水注入池內，水溫恒定在（24±2）℃，水的高度以高于平臺1 cm 為宜。正式實驗前1 d，將小鼠帶至實驗房間內，放在水迷宮平臺上10 s 以適應環境，以SW 象限為入水點讓每只小鼠在水池內自由游泳60 s，以排除小鼠視力、運動障礙對實驗結果的干擾。

4.2.1 定位航行實驗 將各組小鼠按尾部編號依次從4個象限面壁放入水中，記錄每只小鼠在4個象限從入水到游上平臺所用的時間（逃避潛伏期），若60 s 內小鼠未游上平臺，引導其找到平臺，并于平臺上學習30 s，逃避潛伏期記為60 s。定位航行實驗訓練5 d。

4.2.2 空間探索實驗 訓練第6 天時撤除平臺，將小鼠直接從SW 象限（NE 象限的對側）放入水池，記錄60 s 內其穿越平臺的次數。空間探索實驗訓練1 d。

4.3 取材方法 行為學檢測結束后，所有小鼠采用異氟烷吸入麻醉，固定四肢，打開腹腔，暴露腹主動脈，用1 mL 無菌注射器從腹主動脈處緩慢吸取血液后，置于促凝管內靜置離心。打開胸腔，暴露心臟，于心尖處進針至主動脈弓內，注入0.01 mol/L 的PBS溶液，同時剪開右心耳，使血液流出至肝臟變為淺棕色，清澈液體從右心耳流出后，于冰上沿著胃幽門端向下找到一囊狀物（盲腸），取下其后約3 cm 的結腸組織。結腸組織采用PBS溶液沖洗后，置于-80 ℃冰箱儲存。

4.4 ELISA 檢測各組小鼠血清及結腸TNF-α、IL-1β和IL-18 含量 每只小鼠分別稱取20 mg 結腸組織，加入適量PBS 溶液，充分勻漿后收集上清液，分裝備檢。具體操作按說明書進行。

4.5 Western blot 檢測小鼠結腸NLRP3 蛋白表達采用RIPA 裂解液提取結腸組織總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，根據濃度配制蛋白樣品，并于SDSPAGE 上分離，隨后轉膜，封閉，于4 ℃搖床上孵育Ⅰ抗過夜（NLRP3：1∶1 000；β-actin：1∶1 000），Ⅱ抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，ECL 化學發光成像，Image J 分析并計算目的蛋白相對表達量。

5 統計學處理

使用GraphPad Prism 8.0 和SPSS 25 處理數據。結果以均數±標準差（mean±SD）形式表示。所有數據符合正態分布則采用單因素方差分析，重復測量資料采用重復測量的方差分析；進一步兩兩比較時，方差齊用Bonferroni法，方差不齊采用Dunnett T3法；不符合正態分布的數據，采用Kruskal-Wallis 檢驗，菌群結果則采用Wilcox 檢驗；STAMP 結果采用Welch檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 Morris水迷宮實驗

1.1 定位航行實驗 隨著訓練天數的增加，各組小鼠逃避潛伏期總體均呈下降趨勢。從第2 天開始，與對照組比較，模型組逃避潛伏期延長（P＜0.05），第3 天開始，模型組小鼠逃避潛伏期顯著延長（P＜0.01）；與模型組比較，隨著訓練天數的增加，電針組逃避潛伏期的下降趨勢更為顯著，且在第5 天，其逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05）。見圖1A。

1.2 空間探索實驗 與對照組比較，模型組小鼠穿越平臺次數顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，電針組穿越平臺次數增加（P＜0.05）。見圖1B。

Figure 1. Comparison of escape latency（A）and number of crossing the platform（B）in each group of mice. Mean±SD.n=7.*P＜0.05，**P＜0.01vs control group；#P＜0.05vs model group.圖1 各組小鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數比較

2 結腸組織中NLRP3蛋白的表達

與對照組比較，模型組小鼠結腸組織中NLRP3表達顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，電針組NLRP3表達降低（P＜0.05）。見圖2。

Figure 2. Comparison of expression of NLRP3 in colon of mice in each group. Mean±SD.n=4.**P＜0.01vs control group；#P＜0.05vs model group.圖2 各組小鼠結腸組織中NLRP3表達的比較

3 結腸組織中炎癥因子的含量

與對照組相比，模型組結腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-18 含量顯著增高（P＜0.01）；與模型組相比，電針組TNF-α、IL-1β 和IL-18 含量降低（P＜0.05）。見圖3。

Figure 3. Comparison of the contents of TNF-α，IL-1β and IL-18 in colon of mice in each group. Mean±SD.n=7.**P＜0.01vs control group；#P＜0.05vs model group.圖3 各組小鼠結腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-18含量比較

4 血清炎癥因子含量

與對照組相比，模型組血清TNF-α、IL-1β 和IL-18 含量顯著增高（P＜0.01）；與模型組相比，電針組血清TNF-α、IL-1β 和IL-18 含量降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-18含量的比較Table 1. Comparison of the contents of TNF-α，IL-1β and IL-18 in serum of mice in each group（ng/L. Mean±SD.n=7）

5 腸道菌群多樣性分析

Shannon指數結果顯示（表2），與對照組相比，模型組小鼠Shannon 指數降低，腸道菌群多樣性減少，電針干預后，其Shannon指數增高，菌群多樣性增加，但差異均無統計學意義；Chao1 指數結果顯示（表2），與對照組相比，模型組Chao1 指數降低，腸道菌群數目減少（P＜0.05），電針干預后，Chao1 指數增高，菌群數目增加（P＜0.05）；Goods_coverage 指數各組無明顯變化，見表2；Shannon 曲線結果及PCOA 分析結果見圖4，3 組組內各樣本間距離較小，組間各樣本間距離較大。

6 門水平菌群組成分析

在門水平，3 組小鼠糞便菌群均以Bacteroidetes（擬桿菌門）和Firmicutes（厚壁菌門）為主，兩者相對豐度總和在對照組、模型組、電針組中分別占比97.17%，98.17%和94.46%。除此之外，豐度排名前10 的菌群還有Actinobacteria（放線菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Epsilonbacteraeota、Verrucomicrobia（疣微菌門）、Patescibacteria、Deferribacteres（脫鐵桿菌門）、Cyanobacteria（藍藻菌門）和Tenericutes（軟壁菌門）。與對照組相比，模型組小鼠糞便擬桿菌門相對豐度增高（P＜0.05），厚壁菌門、Patescibacteria和軟壁菌門相對豐度降低（P＜0.05），電針干預后擬桿菌門相對豐度輕度降低，厚壁菌門、Patescibacteria、軟壁菌門相對豐度輕度升高，但差異較模型組均無統計學意義。見圖5。

Figure 5. Relative abundance of microbiota in top 10 at the phylum level in each group.n=6.圖5 各組在門水平排名前10的菌群的相對豐度

7 組間差異菌屬的STAMP分析

在屬水平，各組菌群分析結果見圖6。與對照組相比，模型組Lactobacillus（乳桿菌）、Candidatus Saccharimonas、Ruminiclostridium 6（瘤胃梭菌6）、Ruminococcaceae UCG-014（瘤胃球菌UCG-014）、Ruminiclostridium 9（瘤胃梭菌9）、Parabacteroides（副擬桿菌）、Christensenellaceae R-7 group、Eubacterium nodatum group、Family ХШ AD3011 group、Ruminococcaceae UCG-004、GCA-900066225、UBA1819、A2、Candidatus Soleaferrea、Anaerofustis（厭氧菌）（均P＜0.05）相對豐度顯著降低（P＜0.05）；uncultured Bacteroidales bacterium、Others、uncultured organism、Rikenella（理研菌）、Coriobacteriaceae UCG-002（紅蝽菌UCG-002）（均P＜0.01）、Parasutterella（副薩特氏菌）、Marvinbryantia、Ruminococcus torques group相對豐度增高（P＜0.05）。與模型組相比，電針組副薩特氏菌、Streptococcus（鏈球菌）、Rikenella、Caulobacter相對豐度降低（P＜0.05）；Muribaculum、Candidatus Saccharimonas、Adlercreutzia、mouse gut metagenome、uncultured diatom、hgcl clade、Cyanobium PCC-6307、metagenome、Candidatus Methylopumilus、Microcystis PCC-7914相對豐度增高（P＜0.05）。

Figure 6. STAMP analysis of differential microflora between the control group and the model group（A），the model group and the EA group（B）at the genus level.n=6. The bar plot shows mean proportions of differential microflora at genus level，the difference in proportions between the groups is shown with 95%confidence intervals，and onlyP＜0.05 are shown.圖6 對照組與模型組及模型組與電針組在屬水平差異菌群的STAMP分析

在屬水平，三組乳桿菌、雙歧桿菌和副擬桿菌相對豐度比較結果見圖7，與對照組相比，模型組乳桿菌和副擬桿菌相對豐度降低（P＜0.05），雙歧桿菌相對豐度稍有降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）；電針干預后，三者豐度增高，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。

Figure 7. Comparison of relative abundance ofLactobacillus（A），Bifidobacterium（B）andParabacteroides（C）among different groups at genus level. Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01vs control group.圖7 各組屬水平乳桿菌、雙岐桿菌和副擬桿菌相對豐度比較

討論

AD 是一種老年人常見的神經精神類疾病，認知能力下降是其早期的癥狀之一。研究顯示［15］，外周血炎癥反應是認知能力下降的危險因素，其與年齡相關的認知能力下降正相關。作為替代醫學的組成部分，電針被廣泛用于神經精神類疾病的治療，并被證實通過調節腸道菌群，借助于“微生物-腸-腦軸”改善衰老大鼠的認知障礙和中樞神經炎癥反應［16］。與以往僅關注AD 小鼠腦部病變的研究不同，本實驗以“微生物-腸-腦軸”為著眼點，探討電針對AD 小鼠腸道菌群及相關炎癥因子的影響，分析電針改善其認知障礙的可能機制。

作為胃腸道兩大優勢菌門，厚壁菌門和擬桿菌門比值（F/B）的增加或減少分別與肥胖、炎癥性腸病的發展有關［17］。Cui等［18］認為，厚壁菌門豐度與胃腸道炎癥負相關，在潰瘍性結腸炎小鼠中F/B 值降低，推測F/B 值的降低與結腸炎癥性反應有關。本實驗糞便菌群組成結果顯示，APP/PS1小鼠糞便擬桿菌門豐度增加，厚壁菌門豐度降低，F/B 值降低，電針治療在一定程度上可提高其F/B 值。表明APP/PS1小鼠腸道可能存在炎癥反應，而電針治療可以通過調節厚壁菌門、擬桿菌門的豐度來改善其腸道炎癥反應。

研究表明［19］，在急性壞死性胰腺炎和藥物誘導性關節炎大鼠糞便中，Candidatus Saccharimonas豐度降低，且其與IL-17 和TLR4 等炎癥相關蛋白的水平負相關，推測其在維持腸道的正常功能中發揮作用。Chen等［20］觀察到，在腸易激綜合征小鼠糞便中，副擬桿菌屬豐度降低，副薩特氏菌屬豐度增高，且副擬桿菌屬與腸道慢性炎癥負相關，副薩特氏菌屬與腸道慢性炎癥正相關。同時研究顯示［21］，理研菌與IL-2 和IL-4 等炎癥因子正相關，并與慢性全身性炎癥性疾病相關，表明其可能促進炎癥反應。作為炎癥過程的啟動器，NLRP3能識別病原體并被其激活，導致IL-1β 和IL-18 等炎癥因子釋放，引起炎癥級聯反應［22］。在本研究中，APP/PS1小鼠糞便中Candidatus Saccharimonas、副擬桿菌屬豐度降低，副薩特氏菌屬、理研菌屬豐度增高，促炎菌與抗炎菌失衡，腸道菌群微環境破壞，NLRP3被過度激活，其下游炎癥因子IL-1β、TNF-α 和IL-18 過度釋放，腸道慢性炎癥反應明顯，外周血炎癥因子IL-1β、TNF-α 和IL-18 水平顯著增高，電針干預后，上述促炎菌豐度降低，抗炎菌豐度增高，促炎菌與抗炎菌趨近平衡，腸道微環境向正常狀態轉換，NLRP3表達被抑制，下游炎癥因子釋放減少，腸道和外周血炎癥反應減輕，表明電針可能通過調控腸道菌群，抑制其導致的炎性小體的激活和炎癥因子的釋放，發揮抗炎保護作用，減輕腸源性和外周血炎癥反應。

研究表明［23-25］，外周血TNF-α 和IL-1β 水平增高可導致血腦屏障（blood brain barrier，BBB）緊密連接蛋白claudin-5 和ZO-1 表達降低，且其與血管內皮細胞TNF-α 和IL-1β 受體結合后可損傷內皮細胞并誘導基質金屬蛋白酶2 和9 表達，破壞基底膜成分，導致BBB 結構破壞，通透性增加。BBB 通透性增加后，外周血炎癥因子及有害物質進入腦組織，導致小膠質細胞或相關炎癥反應通路激活，誘發中樞神經炎癥反應，引起神經元損傷，認知能力下降［16，26］。研究顯示［27-29］，AD小鼠BBB緊密連接蛋白ZO-1、claudin-5和occludin 表達降低，BBB 通透性增加，而電針治療可以上調上述蛋白的表達，改善小鼠BBB 結構。He等［16］證實電針刺激還可降低衰老大鼠血清IL-1β、TNF-α和LPS的水平，上調BBB 中ZO-1的表達，降低BBB 通透性，抑制海馬LPS 的表達和TLR4/NF-κB 通路的激活，發揮抗炎和保護海馬神經元的作用，改善大鼠的認知障礙。由此推測電針治療改善AD 小鼠認知障礙的機制可能也與調節BBB 結構及通透性，減輕外周炎癥因子所致中樞炎癥通路的激活，減少神經元損傷有關。

本實驗研究結果顯示，除炎癥相關菌群改變外，APP/PS1小鼠糞便乳桿菌、雙歧桿菌、Muribaculum等與認知相關的菌群豐度也降低。研究表明［30］乳桿菌、雙歧桿菌與γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的產生密切相關。GABA 是腦組織中的一種抑制性神經遞質，與神經系統功能的發育相關，GABA系統的功能紊亂會導致認知功能損傷［31］；相關分析顯示［32］，Muribaculum相對豐度與APP/PS1小鼠認知功能正相關。本實驗結果顯示，電針干預后APP/PS1小鼠逃避潛伏期縮短，空間探索能力提高，腸道Muribaculum相對豐度顯著增高，乳桿菌、雙岐桿菌相對豐度也呈上升趨勢，表明電針可能通過增加認知相關菌屬的豐度來改善AD小鼠的認知能力。

綜上所述，電針改善APP/PS1 小鼠認知障礙的機制可能與其調控腸道菌群，降低結腸NLRP3 蛋白表達和結腸、外周血IL-1β、IL-18 和TNF-α 水平，減輕腸源性及外周血炎癥反應，從而降低認知障礙的危險因素有關。但炎癥反應與認知障礙間的具體關系以及電針治療在其中的作用機制仍需我們進一步研究。