Eph互作交換蛋白家族活性調控及調控異常相關疾病的研究進展*

陳 鳳， 吳英杰， 秦應和

（中國農業大學動物科學技術學院，北京 100193）

Eph（erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma）互作交換蛋白（Eph-interacting exchange protein，Ephexin）是鳥苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）家族的最大亞家族Dbl（diffuse B-cell lymphoma）的亞群之一，主要在Ephrin 配體與Eph受體介導的信號下激活，從而參與Rho蛋白的活性調節［1-2］。Rho 蛋白是一類分子大小為20～30 kD 左右的Ras 超家族成員之一，因其自身具有一段能將GTP 水解成GDP 的保守氨基酸序列，所以又叫Rho GTP 酶。RhoGEFs 是Rho 蛋白的三大調節因子之一，與Rho GTPase 活化蛋白（Rho GTPase-activating proteins，RhoGAPs）及Rho 鳥苷酸解離抑制因子（Rho guanine nucleotide dissociation inhibitors，RhoGDIs）共同控制非活性Rho-GDP 與活性Rho-GTP之間的動態平衡，對細胞生長、遷移、凋亡、細胞周期、細胞骨架形成、基因表達及病毒感染等生理生化活動至關重要。目前為止，已經確認5個與Eph互作的交換蛋白，根據發現的時間先后順序分別命名為Ephexin1、Ephexin2、Ephexin3、Ephexin4 和Ephexin5，它們都是Rho、Ras 相關的C3 肉毒毒素底物1（Rasrelated C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）和細胞分裂周期蛋白42（cell division cycle protein 42，Cdc42）等常見Rho 蛋白的GEFs。Ephexins 的鳥苷酸交換活性失調及Rho 蛋白激活異常都可能導致癌癥等諸多疾病的發生，所以了解Ephexins 活性調控的分子機制及Ephrin/Eph 信號如何參與調控Rho 蛋白的活性對Ephexins調控相關疾病的治療至關重要。

1 Ephexins家族

1.1 Ephexins 的結構與功能 Ephexins 家族的共同結構特點為含有一個由200 個氨基酸組成的Dbl homology（DH）結構域和與其串聯的Pleckstrin homology（PH）結構域。除了Ephexin5 之外，其它Ephexins 家族成員還含有一個SH3 結構域。Ephexins 的功能域在同源蛋白中高度保守，其中DH 域主要負責GEFs的鳥苷酸交換活性，并與相鄰PH 域形成鳥嘌呤核苷酸交換反應的最小催化單元，DH 域的結構阻遏量決定了Ephexins 和Rho 蛋白之間的偶聯特異性，因此，一些Ephexins 成員對Rho 蛋白的鳥苷酸交換活性具有特異性［3］。而PH 域則協同促進Rho 蛋白的活化，介導GEFs的亞細胞定位［4］。SH3域可以通過分子內或分子間的互作而調節含有該結構域的GEFs 的活性［5］。除此之外，一些Ephexins家族成員的其他結構域也可以通過分子內互作阻礙其鳥苷酸交換活性，比如Ephexin4 的N20 結構域（第234 和378 位氨基酸之間的區域），Ephexin3 的N 端螺旋結構域（Helix）及Helix 和DH 域之間一段富含脯氨酸的基序（PxxP）等。雖然第一個Ephexin 被發現距今已20 余年，但Ephexins 在生理和病理環境中的功能及調節機制最近才被揭示。

1.2 Ephexins激活的分子機制

1.2.1 Ephrin/Eph 信號對Ephexins活性的調控 細胞內的Ephexins 主要受Ephrin/Eph 信號調控。Eph受體是哺乳動物基因組中最大的受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）家族，屬于跨膜RTK超家族?；谛蛄型葱约皩phrinA和EphrinB配體的親和性，Eph受體分為EphA和EphB兩種。通常情況下，EphA 與EphrinA 互作，EphB 與EphrinB 互作。然而也有一些例外，例如，EphrinB2 和EphrinB3可以與EphA4結合，EphrinA5可以與EphB2結合［6-8］。Ephrin/Eph互作提供了一種獨特的雙向信號機制，即Eph受體誘導的信號稱為正向信號，Ephrin配體啟動的信號稱為反向信號，且正反向信號均可通過酪氨酸磷酸化依賴或非依賴轉導途徑進行轉導［9］。Ephexins 作為Eph 受體的直接下游蛋白，在Ephrin/Eph 介導下參與軸突導向、細胞遷移與凋亡、血管生成與血管平滑肌收縮等多種下游信號通路。目前為止，只有Ephexin2的Eph受體還未見報道［2］。

Ephexin1 在EphA4 的誘導下激活RhoA；缺失Ephexin1 影響小鼠出生后發育過程中突觸的成熟，從而導致成年小鼠神經肌肉接頭處神經傳遞受損與肌無力；Ephexin1 缺失引起的RhoA 活性降低是神經肌肉接頭異常的主要原因［10］。在骨骼肌細胞中，EphrinA 與EphA4 結合誘導Ephexin1 的第87 位酪氨酸發生磷酸化，從而增強Ephexin1對RhoA 的鳥苷酸交換活性，但不改變其對Rac1 或Cdc42 的鳥苷酸交換活性［11］。Chang 等［12］首次通過體內實驗表明，Ephexin1 在雛雞和小鼠胚胎中指導脊髓外側運動柱的軸突導向，并提到Ephexin1 可能在EphB 信號轉導中發揮一定的作用。

Ephexin3 在EphA4 的誘導下主要激活RhoA，參與細胞遷移和肌動蛋白動力學的調控［13-14］。Ephexin3與Ephexin1 的作用機制不同。在神經肌肉接頭的早期發育中，Ephexin1 發揮關鍵作用，而Ephexin3 的缺失雖然會導致RhoA 和Cdc42 的活性降低，但是不會影響神經肌肉接頭的早期發育［14］。Wang 等［15］通過體外實驗證明Ephexin3 還可以弱激活Rho 家族的其它成員RhoC 和RhoG，但具體生理功能還有待進一步研究。

Ephexin4 在EphA2 的誘導下特異性激活RhoG，從而參與乳腺癌細胞遷移。EphA2 受體的第897 位絲氨酸磷酸化既可以增強其與Ephexin4 的結合，促進癌細胞的遷移［16］，也可以招募RhoG 定位到細胞膜，促進細胞分裂M期的正常進行［17-18］。

Ephexin5 的DH-PH 域酪氨酸在EphrinA/EphA4介導下發生磷酸化，磷酸化的Ephexin5 進一步激活RhoA，從而參與血管平滑肌收縮相關的應力纖維的形成［19］。正常生理狀態下，Ephexin5 與EphB2 結合抑制興奮性突觸的形成［20］。當EphrinB 與EphB2 結合誘導Ephexin5 磷酸化，使其被泛素-蛋白連接酶E3A 泛素化并被蛋白酶體降解時，Ephexin5 對興奮性突觸形成的抑制效應才被解除。另外，蛋白激酶C可以介導Ephexin5 的第107 和109 位絲氨酸殘基發生磷酸化，以非配體依賴形式激活RhoA 并參與調控神經元樹突棘的形成［21］。上述研究結果表明，Ephexins通過Ephrin/Eph信號參與多種細胞事件。

1.2.2 Ephexins 自抑制狀態的調控 在基礎狀態下，Ephexins 的鳥苷酸交換活性是受到抑制的，當Ephexins 與Eph 結合才能誘導Rho 蛋白的激活。目前為止，研究者普遍認為Ephexins 的自抑制狀態是Ephexins分子內互作封閉其催化區域所致。

Ephexin1 與Ephexin3 的活性調控機制相似。Ephexin3 的活性受N 端Helix 區域與DH 域的互作影響。突變Helix 區域的關鍵氨基酸或截短此段氨基酸序列都可以完全解除Ephexin3 的自抑制狀態。另外，Ephexin3 的第1 097 和1 100 位酪氨酸磷酸化也可以破壞其分子內互作，使RhoA 與Ephexin3 的DH域結合并被激活［22］。He 等［23］發現，Ephexin3 的SH3域與PxxP 域的結合是Ephexin3 自抑制狀態穩定的前提，通過人為設計靶向SH3 域的肽段也可以解除Ephexin3 的自抑制狀態。鳥嘌呤核苷酸交換分析也證實這種靶向SH3 的肽段能有效增強Ephexin3 催化的鳥苷酸交換反應［24］，但是生理狀態下的具體功能有待進一步研究。

Ephexin4 的活性調控機制不同于Ephexin1 和Ephexin3，其SH3 域與N20 域互作形成低聚物，阻礙RhoG 的結合與激活。突變SH3 域與N20 域互作區域的關鍵氨酸殘基，Ephexin4 與RhoG 的結合增加，RhoG 活化增強［25］。當吞噬和細胞運動蛋白1（engulfment and cell motility protein 1，Elmo1）存在時，由于Elmo1 可以結合Ephexin4 的SH3 域，導致SH3 域與N20 域的分子內互作中斷，從而促進RhoG 與Ephexin4 結合，協同促進凋亡細胞的清除［26-27］。總之，突變、截短及磷酸化分子內互作區域的關鍵氨基酸是解除Ephexins家族自抑制狀態的三大主要方法。

Ephexin2 和Ephexin5 分子內互作介導的自抑制暫時還沒有報道。

2 Ephexins對Rho蛋白的調控

Ephexins 作為GEFs 家族中的一員，激活之后調控Rho 蛋白活性的機制與其他RhoGEFs 一樣，通過促進Rho-GDP 向Rho-GTP 的轉換激活Rho 蛋白。GDP 和GTP 結合態的變化伴隨Rho 蛋白構象的改變，從而決定了Rho 蛋白對下游效應因子的親和力，親和作用的變化直接導致相應下游信號通路的激活，并以此產生對應的細胞反應。

RhoGAPs 通過水解Rho-GTP 上的GTP 促進Rho-GDP 產生，雖然Rho 蛋白自身也具有GTP 水解活性，但仍然需要RhoGAPs 加速GTP 的水解，以達到高效構象轉換的目的［28］。

RhoGDIs 在胞質中結合并隱藏Rho 蛋白的疏水異戊烯基團，抑制Rho 蛋白上的GDP 解離和GTP 水解活性，促使Rho 蛋白遠離細胞內活躍的膜位點而隔離在胞質當中［29-30］。

3 Ephexins調控的相關疾病

Ephexins 家族成員的活性失調、功能異常及其相關聯的Rho 蛋白活性異常都會導致嚴重的疾病。另外，已經在不同類型的癌癥中觀察到Eph 受體或Ephrin 配體的異常表達或突變［2］。所以從這些信號模塊及Rho 蛋白調節因子著手可能是Ephexins 調控相關疾病治療的一個方向。

早期腦損傷是蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）患者死亡的主要原因。Fan 等［31］發現，SAH 小鼠體內EphA4 及其下游蛋白Ephexin1、RhoA 和Rho 相關激酶2（Rho-associated kinase 2，ROCK2）的表達顯著升高，siRNA 敲減EphA4之后，SAH 相關異常表型得到改善，提示EphA4/Ephexin1/RhoA/ROCK2 通路可能為人類SAH 的治療提供新的線索。另外，EphA4 及其下游蛋白Ephexin1 還與抑郁癥相關聯。當使用EphA4抑制劑抑制抑郁樣小鼠體內的EphA4表達時，小鼠的抑郁樣表型明顯減輕，所以靶向EphA4的藥物研究可能是間接治療抑郁癥的一個潛在研究方向［32］。因為一些直接治療的藥物具有明顯的副作用，比如，去甲丙咪嗪（desipramine）作為一種抗抑郁藥物，通過促進EphA4 的聚集而過度激活其下游效應因子Src，觸發長時程增強效應衰減，從而導致記憶受損［33］。而且EphA4 正向信號的過度激活會破壞脊柱的形態并阻礙其功能［34］?？傊?，由于Ephexin1 在神經元發育和突觸穩態方面的作用，所以在中樞神經系統損傷后的恢復及抑郁癥患者中均能觀察到Ephexin1的異常［31-32］。

Ephexin2 主要在腫瘤中發揮作用。非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）是一種常見的肺癌，約占所有肺癌類型的85%左右［35］。NSCLC 患者體內的Ephexin2 水平明顯高于正常人，并以一種獨立于RhoA 的方式激活MAPK/ERK 通路并促進NSCLC 的增殖和轉移。Li等［36］的研究表明，miR-29b通過下調Ephexin2 的表達可以抑制NSCLC 的發展。另外，肺癌患者組織中粒狀頭樣轉錄因子2（grainyhead-like transcription factor 2，GRHL2）高表達，Pan 等［37］發現GRHL2 可能通過靶向結合下游效應蛋白RhoG 抑制NSCLC 的轉移，所以Ephexin2 與RhoG 在NSCLC 中的關系值得進一步研究。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是人類最致命的癌癥之一，中國是全球肝癌發病率和死亡率最高的國家。目前為止，有關肝癌發生發展的研究，大部分集中于RNA 甲基化修飾［38］。Zhou 等［39］的研究表明，Ephexin2 是HCC 中miR-503 的直接靶基因，首次證明miR-503 通過下調Ephexin2 的表達可以抑制肝癌細胞的增殖與轉移。另外，RhoC 的表達增加影響HCC 細胞的轉移，抑制RhoC 的表達能有效抑制HCC細胞的侵襲和遷移，但對細胞的存活和增殖沒有明顯影響［40］。目前為止，Ephexin2 與RhoC 在HCC 中是否協同發揮作用尚未知，但是Ephexin2 與RhoC 很可能成為肝癌的預后指標及治療靶點。

Ephexin3 主要在乳腺癌細胞系及原發性乳腺癌中表達，提示Ephexin3 可能在乳腺癌中發揮一定功能。目前為止，Ephexin3 相關的乳腺癌介紹較少，不過乳腺癌患者中常見EphA2 的過表達，以非配體依賴形式促進癌細胞的遷移和侵襲［41］。而乳腺癌作為第二普遍和致命的惡性腫瘤，進一步研究Ephexin3和EphA2 在乳腺癌中關系可能很有必要。另外，肺癌患者的全基因組測序結果顯示Ephexin3 突變頻繁［42］。宮頸癌、結直腸癌及肺癌患者體內都能觀察到較高水平的Ephexin3，并且Ephexin3 與Src 的水平越高，患者生存時間越短［43-44］。

Ephexin4 對癌細胞的增殖、生長及腫瘤發生至關重要。Ephexin4 在曲酸刺激的A375 惡性黑素瘤細胞中表達下調，是黑色素瘤細胞中的腫瘤抑制基因，提示其可能參與癌癥的預防［45］。但是結腸癌患者體內的Ephexin4 水平明顯升高，Ephexin4 誘導的結腸癌細胞增殖與遷移依賴于Src 家族激酶成員FYN，通過敲減FYN的表達可以降低Ephexin4 的蛋白水平，從而抑制結腸癌細胞進展［46］。因此，聯合靶向Ephexin4和FYN可能是一種相對有效的結腸癌治療方法。在乳腺癌中，Ephexin4 以RhoG 依賴的方式調節乳腺癌細胞的遷移［41］。另外，EphA2的第897位絲氨酸磷酸化可以增強其與Ephexin4 的結合，進一步促進癌細胞的遷移［16］。Ephexin4 還與腦腫瘤的發生有關，在少突膠質細胞瘤患者中，Ephexin4 的錯義突變（2125G 到2125A）明顯高于正常人，但是具體發病機制有待進一步闡明［47］。

Ephexin5 主要與阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）及癲癇等神經系統疾病有關。AD 的病理特征之一就是β-淀粉樣蛋白沉積，且AD患者大腦海馬中的Ephexin5 表達明顯高于正常人。在AD 小鼠模型中，利用shRNA 敲減Ephexin5 或通過Rho 激酶抑制劑處理AD小鼠，都可以挽救AD的行為缺陷，大腦海馬中β-淀粉樣蛋白沉積明顯降低［48-49］，提示靶向AD 患者海馬中β-淀粉樣蛋白是治療AD 的一個方向。癲癇是Angelman 綜合征（Angelman syndrome，AS）的特征之一，AS 小鼠模型重現了AS 患者的標志性特征，其中Ephexin5 蛋白水平升高且發生折疊錯誤是特征之一。Mandel-Brehm 等［50］發現，降低活性調節的細胞骨架相關蛋白（activity-regulated cytoskeletal-associated protein，Arc）表達可以緩解AS 引起的癲癇，但是降低AS 小鼠Ephexin5 表達并不會改善AS的相關缺陷。癲癇患者的Ephexin5發生1810C至1810T 的錯義突變，從而降低Ephexin5 對RhoA 的鳥苷酸交換活性［51］，所以可能是Ephexin5 的鳥苷酸交換活性而不是其表達水平影響了AS 患者的神經元興奮性。另外，胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）患者腫瘤組織中的Ephexin5表達上調，促進PDAC 細胞的增殖與遷移［52］。因此，Ephexin5可能是PDAC的治療靶點之一。

4 結語

Rho 蛋白在RhoGEFs、RhoGAPs 及RhoGDIs 等調節因子的調控下參與多種細胞生命活動。Ephexins作為RhoGEFs 中的一員，主要在Ephrin/Eph 信號的介導下參與Rho 蛋白的活性調節。大量研究表明，Ephexins 分子內互作使Ephexins 的鳥嘌呤核苷酸交換活性處于受抑制的基礎狀態。Ephexins 的激活及其對Rho 蛋白的調控對生物體的正常生理生化活動至關重要。關于Ephexins 自抑制狀態的解除及活性異常相關疾病之間的關系復雜且尚不完全清楚。深入了解Ephrin/Eph 信號介導的Ephexins 活性調節對于闡明相關疾病的發生機制十分重要，也將為臨床治療提供靶點，促進相關藥物的研發。