分子動(dòng)力學(xué)模擬揭示C677T誘導(dǎo)MTHFR及其配體FAD解離的分子機(jī)制

王若男 曹錕

摘要：亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）C677T的基因多態(tài)性會(huì)影響葉酸代謝。為了研究C677T（A177V）對(duì)于該酶構(gòu)象的影響，我們采用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法，針對(duì)MTHFR-野生型（MTHFR-WT）和A177V突變體分別進(jìn)行了100?ns的模擬計(jì)算，分析了該酶整體構(gòu)象差異及其FAD活性中心的變化。研究發(fā)現(xiàn)，與MTHFR-WT相比，A177V模擬體系無(wú)法趨于穩(wěn)定，突變體a-C的均方根漲落值升高，回旋半徑值增大，溶劑可及表面積增大，這些結(jié)果都表明，A177V突變會(huì)導(dǎo)致該酶的整體結(jié)構(gòu)松散且不穩(wěn)定升高;進(jìn)一步的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量及FAD活性中心的分析表明，A177V突變會(huì)引起部分a螺旋含量降低、b折疊含量升高，且造成FAD結(jié)合位點(diǎn)殘基的空間距離增大，這些結(jié)果表明A177V突變會(huì)破壞FAD結(jié)合位點(diǎn)微環(huán)境。本研究在原子水平揭示了A177V突變會(huì)誘導(dǎo)MTHFR激活劑FAD解離的關(guān)鍵信息。

關(guān)鍵詞：分子動(dòng)力學(xué)模擬;亞甲基四氫葉酸還原酶;黃素腺嘌呤二核苷酸;突變體;穩(wěn)定性

亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR是機(jī)體葉酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶，它能催化5，10-亞甲基四氫葉酸向5-甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)換，隨后會(huì)進(jìn)入甲基傳遞通路，為DNA、蛋白質(zhì)甲基化提供甲基，為同型半胱氨酸提供甲基形成甲硫氨酸。葉酸是人體體內(nèi)重要的水溶性維生素B族營(yíng)養(yǎng)素，是對(duì)具有蝶酰谷氨酸分子結(jié)構(gòu)化合物的總稱[1-2]。葉酸在細(xì)胞分裂、蛋白質(zhì)合成等途徑中具有重要作用，葉酸攝入不足或者代謝障礙，可能造成人體同型半胱氨酸積累、血紅蛋白生成減少進(jìn)而導(dǎo)致貧血，甚至可能導(dǎo)致神經(jīng)管畸形、智力低下、心腦血管等疾病[3]。

MTHFR?C677T具有基因多態(tài)性，這直接決定了酶活性以及葉酸利用率。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，與MTHFR-WT相比，C677T基因突變會(huì)造成該酶的熔解溫度下降6℃且酶活性僅有26%，從而引起葉酸、甲基代謝紊亂，所以該酶參與了人類重要疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。本研究項(xiàng)目將通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬的手段揭示C677T對(duì)于該酶構(gòu)象的影響，并闡明其誘導(dǎo)FAD配體解離的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1分子模擬的條件

本研究中大腸桿菌MTHFR的結(jié)構(gòu)（PDB：1b5t）來(lái)自于RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）。在使用Gromacs2020.4軟件進(jìn)行分子模擬計(jì)算之前，需要先除去MTHFR結(jié)構(gòu)中的結(jié)晶水和雜質(zhì)離子，此后需要通過(guò)PymoL軟件將Ala-177突變成Val-177，即A177V。針對(duì)MTHFR和A177V設(shè)置兩個(gè)獨(dú)立的體系，采用SPC水模型、Gromos43a1力場(chǎng)進(jìn)行總時(shí)長(zhǎng)為100?ns模擬[5-6]。將MTHFR和A177V的晶體構(gòu)象放置在立方周期盒中并作為起始構(gòu)象，將蛋白與盒子邊界的最小距離設(shè)定為1.0?nm，模擬系統(tǒng)的周期性邊界條件適用于X/Y/Z三個(gè)方向。在溶膠中加入0.15?mol/L?NaCl鹽溶質(zhì)以便于中和蛋白體系的電荷。接下來(lái)，采用蛙跳算法計(jì)算每個(gè)原子的運(yùn)動(dòng)，用粒子網(wǎng)格法計(jì)算PME靜電相互作用。我們利用最速下降能量法進(jìn)行400步能量最小化，并對(duì)MTHFR和A177V的模擬體系進(jìn)行了50?ps的位置約束仿真。采用隨機(jī)初始速度作為正式動(dòng)力學(xué)模擬的初速度。利用PyMOL、VMD以及Origin8.5軟件生成數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.2模擬結(jié)果的分析

我們利用VMD-1.9.1軟件觀察兩個(gè)不同模擬體系的軌跡中蛋白構(gòu)象變化[7]，采用gmx?rms、gmx?rmsf和gmx?gyrate工具分別計(jì)算了蛋白的RMSD變化、每個(gè)氨基酸殘基的a-C的均方根漲落RMSF以及回旋半徑[8]。并采用gmx?distance分別測(cè)量了MTHFR和A177V中的典型FAD結(jié)合位點(diǎn)殘基的平均距離。并用PyMOL繪制結(jié)構(gòu)圖，用Origin8.5軟件繪制曲線圖。

2?結(jié)果與分析

2.1?MTHFR-WT與A177V的整體構(gòu)象變化

大腸桿菌MTHFR酶的三維構(gòu)象主要呈現(xiàn)桶狀結(jié)構(gòu)，由296個(gè)氨基酸殘基組成，其分子量約為33.1?kDa。其中，Ala-177與人類MTHFR中的Ala222相對(duì)應(yīng)，位于桶底附近，遠(yuǎn)離FAD。大多數(shù)a-螺旋位于桶的外側(cè)周圍，主要作用是向內(nèi)形成一個(gè)疏水囊;而桶的內(nèi)部是輔酶因子FAD的主要活性區(qū)域，由7個(gè)b-折疊形成疏水區(qū)域，這對(duì)于穩(wěn)定蛋白的整體構(gòu)象至關(guān)重要。

均方根誤差（root?mean?square?deviation，RMSD）是衡量體系是否達(dá)到平衡狀態(tài)的重要依據(jù)。MTHFR-WT在70?ns即達(dá)到平衡狀態(tài)，對(duì)應(yīng)的平均RMSD值最低約為3.6??（圖1A）;而A177V突變體蛋白的RMSD值在100?ns的總模擬時(shí)間內(nèi)無(wú)法達(dá)到平衡狀態(tài)，其RMSD最大值高達(dá)4.3??以上，說(shuō)明Ala-177殘基被突變成Val-177會(huì)導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。

通過(guò)對(duì)比MTHFR-WT與A177V中每個(gè)a-C原子相對(duì)于其平均位置的漲落（RMSF）值的變化，能夠直觀反應(yīng)出Ala-177突變引起的殘基柔性差異。通常情況下，RMSF值越低則該殘基的靈活性越小，我們將MTHFR-WT的RMSF值定義為正常值;與正常值相比，A177V突變體的多數(shù)殘基的RMSF值增大，這表明Ala-177的突變已經(jīng)對(duì)蛋白的碳骨架的波動(dòng)性造成較大影響（圖1B）。因此，這些結(jié)果都表明A177V的突變會(huì)導(dǎo)致多數(shù)殘基的波動(dòng)性增大，甚至造成蛋白構(gòu)象不穩(wěn)定性，這不利于蛋白發(fā)揮酶活性。

2.2?蛋白的回旋半徑及其構(gòu)象的溶劑可及表面積分析

接下來(lái)，我們統(tǒng)計(jì)了MTHFR-WT及其突變體的回旋半徑（Rg）隨模擬時(shí)長(zhǎng)的變化情況，蛋白的Rg值越大表示蛋白構(gòu)象越靈活，該值越小說(shuō)明構(gòu)象越趨近于剛性。在MTHFR-WT和A177V的體系中，蛋白樣品a-C的Rg值分別為1.77?nm和1.81?nm（圖2A）。接下來(lái)，我們采用gmx?sasa分別計(jì)算了蛋白整體的溶劑可及表面積SASA隨著時(shí)間變化情況，平衡狀態(tài)下的MTHFR-WT所對(duì)應(yīng)的SASA值降低至117.5?nm2，與之相比A177V的SASA值則升高至125.1?nm2（圖2B）。這些結(jié)果說(shuō)明，回旋半徑與溶劑可及表面積的數(shù)據(jù)趨勢(shì)與RMSD及RMSF結(jié)果保持一致，即Val-177突變將導(dǎo)致該酶的空間構(gòu)象由致密變得更加松散，這不利于蛋白構(gòu)象保持穩(wěn)定。該結(jié)論從原子水平解釋了A177V突變體的熔解溫度比野生型下降了6℃這一科學(xué)問(wèn)題。

2.3對(duì)比MTHFR-WT與A177V的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化以及FAD的結(jié)合能力

為了探究Ala-177被突變成Val-177所引起的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化差異，我們采用do_dssp插件解析了蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。A177V模擬體系的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變情況與MTHFR-WT正常體系形成鮮明對(duì)比，MTHFR-WT平均有122個(gè)殘基參與a螺旋的形成，19個(gè)形成b-轉(zhuǎn)角（圖3A）;然而，在A177V突變體中有125個(gè)殘基形成a螺旋，17個(gè)形成b-轉(zhuǎn)角（圖3B）。這些數(shù)據(jù)表明Ala-177被突變成Val-177可能會(huì)導(dǎo)致一部分氨基酸殘基由b-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)化為a螺旋，從而改變了二級(jí)結(jié)構(gòu)含量占比。由于MTHFR酶的b-轉(zhuǎn)角具有穩(wěn)定蛋白骨架的作用，因此b-轉(zhuǎn)角含量的降低可能會(huì)破壞其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，甚至降低該酶的催化活性，這個(gè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的A177V酶活性僅有26%相一致。

由于FAD是MTHFR酶的底物輔酶因子，接下來(lái)我們分析了MTHFR-WT和A177V分別與底物FAD分子的結(jié)合位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)分析，我們確定了大腸桿菌MTHFR-WT的FAD結(jié)合位點(diǎn)殘基為Trp-60、His-88、Arg-118、Gly-119、Asp-120、Ala-132、Trp-152、His-156、Asp-165、Asn-168、Arg-171和Lys-172（圖3C），由此可見(jiàn)FAD的結(jié)合方式極為嚴(yán)苛。然而，上述諸多證據(jù)已經(jīng)揭示A177V突變體的氨基酸殘基波動(dòng)性較大、整體構(gòu)象趨于松散狀態(tài)，因此這些結(jié)合位點(diǎn)殘基之間的空間距離也隨之增大（圖3D），具體表現(xiàn)在Trp-60和His-88與其他殘基之間的距離增大為12.2??和15.9??，而其余結(jié)合位點(diǎn)的空間位置則被壓縮，不利于FAD底物分子的結(jié)合，這可能是由于氨基酸殘基的靈活性較大、局部二級(jí)結(jié)構(gòu)被轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的結(jié)果。總之，這些數(shù)據(jù)從原子水平證實(shí)A177V突變體不利于結(jié)合輔酶因子FAD，故無(wú)法充分發(fā)揮其催化活性。

3?討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Brian?D.Guenther等人已證實(shí)MTHFR-WT的熔解溫度大約為53.1?°C，而A177V的熔解溫度僅有46.0?°C，并且A177V的酶活性僅為野生型的26%[9-10]，然而這一科學(xué)問(wèn)題并未從原子水平角度被更好的解釋。因此，本研究通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬的手段，探究A177V突變體所造成的蛋白構(gòu)象變化，具有一定的生物學(xué)意義。在這項(xiàng)研究中，我們采用分子動(dòng)力學(xué)模擬的手段分析了MTHFR-WT和A177V突變體蛋白的原子空間構(gòu)象差異，從RMSD、RMSF、Rg、SASA、二級(jí)結(jié)構(gòu)改變及FAD結(jié)合能力等方面證實(shí)，A177V突變體會(huì)引起氨基酸殘基的波動(dòng)性增大、碳骨架的不穩(wěn)定性升高、蛋白空間構(gòu)象由致密變得松散等結(jié)論，并導(dǎo)致底物分子FAD的活性區(qū)域被破壞，最終造成該酶的熔解溫度降低以及酶活性降低。在臨床病例中，MTHFR的大多數(shù)突變屬于C677T突變，即形成A177V突變體，這將誘導(dǎo)MTHFR酶無(wú)法正常結(jié)合FAD配體分子。總之，本研究在原子水平揭示了C677T對(duì)于該酶構(gòu)象的影響，并闡明其誘導(dǎo)FAD配體解離的分子機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1]AYGUN?B，AK?DY.vitamin?b12?and?folic?acid?levels?after?iron?therapy?in?iron-deficiency?anemia[J].Cukurova?Anestezi?ve?Cerrahi?Bilimler?Dergisi，2020，3（3）：261-267.

[2]A，EGJ?VERMEULEN，et?al.Effect?of?homocysteine-lowering?treatment?with?folic?acid?plus?vitamin?B6?on?progression?of?subclinical?atherosclerosis：a?randomised，placebo-controlled?trial.Lancet，2019，3（92）：517-522.

[3]HILDEBRAND?LA，DUMAS?B，MILROD?C，et?al.Folate?Deficiency?in?an?Urban?Safety?Net?Population[J].Blood，2020，136（Supplement?1）：46-46.

[4]MD?MARTINIS，SIRUFO?MM，NOCELLI?C，et?al.Hyperhomocysteinemia?is?Associated?with?Inflammation，Bone?Resorption，Vitamin?B12?and?Folate?Deficiency?and?MTHFR?C677T?Polymorphism?in?Postmenopausal?Women?with?Decreased?Bone?Mineral?Density[J].International?Journal?of?Environmental?Research?and?Public?Health，2020，17（12）：4260-4266.

[5]CAO?K，ZHANG?J，MIAO?XY，et?al.Evolution?and?molecular?mechanism?of?PitAs?in?iron?transport?of?Streptococcus?species[J].Journal?of?Inorganic?Biochemistry，2018：113-123.

[6]VITALINI?F，F(xiàn)?NOé，KELLER?B?G.Molecular?dynamics?simulations?data?of?the?twenty?encoded?amino?acids?in?different?force?fields[J].Data?in?Brief，2016，7（C）：582-590.

[7]VERMAAS?JV，HARDY?DJ，STONE?JE，et?al.TopoGromacs：Automated?Topology?Conversion?from?CHARMM?to?Gromacs?within?VMD[J].Journal?of?Chemical?Information?and?Modeling，2016，56（6）：1112-1116.

[8]CHEN?J，III?C.Can?molecular?dynamics?simulations?provide?high-resolution?refinement?of?protein?structure？[J].Proteins：Structure，F(xiàn)unction，and?Bioinformatics，2007，67（4）：922-930.

[9]GUENTHER?B?D，SHEPPARD?C?A，TRAN?P，et?al.The?structure?and?properties?of?methylenetetrahydrofolate?reductase?from?Escherichia?coli?suggest?how?folate?ameliorates?human?hyperhomocy?steinemia.[J].Nat?Struct?Biol，1999，6（4）：359-365.

[10]FROESE?DS，KOPEC?J，REMBEZA?E，et?al.Structural?basis?for?the?regulation?of?human?5，10-methylenetetrahydrofolate?reductase?by?phosphorylation?and?S-adenosylmethionine?inhibition[J].Nature?Communications，2018，9（1）：2261.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（82002104）;廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金項(xiàng)目區(qū)域聯(lián)合基金-青年基金項(xiàng)目（2019A1515?110659）;廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目（A2020381）;2019年度廣東醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位人員科研啟動(dòng)基金（B2019018）;2020年度廣東醫(yī)科大學(xué)科研基金自然科學(xué)類面上培育項(xiàng)目（GDMUM2020016）。

*通訊作者：曹錕（1989-），男，助理研究員，博士研究生，研究方向：醫(yī)學(xué)生物化學(xué)。

作者簡(jiǎn)介：王若男（1991-），女，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)和生物化學(xué)。