生物傳感檢測獨腳金內酯的研究與展望

方 園,姚瑞楓

(湖南大學生物學院化學生物傳感與計量學國家重點實驗室植物功能基因組學與發育調控湖南省重點實驗室,中國湖南長沙410082)

植物激素獨腳金內酯(strigolactones,SLs)是一類由類胡蘿卜素衍生的萜類內酯。SL最初被認為是根際寄生雜草如獨腳金屬(Striga spp.)的萌發刺激物[1],隨后被鑒定為叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)的根源共生信號[2]。直至2008年,SL被鑒定為一種新型植物激素,參與抑制植物分枝的過程[3～4]。SL由全反式-β-胡蘿卜素經過一系列酶催化加工而來,主要在植物根部合成,并被運輸到芽或分泌到根際。目前已鑒定的植物內源性(天然)SL在化學結構上都包含1個三環內酯(ABC-ring)和1個由烯醇醚鍵連接在一起的單環內酯(D-ring)。目前有30種以上天然SL分子在不同植物中被發現[5～6],不同形式的天然SL的區別主要是ABC-ring上不同形式或位置的基團修飾,但是D-ring嚴格保持不變[7]。如圖1所示,根據其是否具有完整的ABC-ring三環結構,SLs可分為典型和非典型兩大類；根據C-ring的立體化學性不同,典型SLs又可分為獨角金屬(strigol-type)和列當屬(orobanchol-type)兩類[8～9]。

圖1 天然的獨腳金內酯及其合成類似物的結構和分類Fig.1 Structures and classification of natural SLs and synthetic SL analogs

研究發現,SL不僅可以調控植物的生長發育過程,包括誘導次生生長、加速葉片衰老、刺激節間生長和根系伸長,抑制腋芽的生長、不定根和側根的形成等[10],還能介導植物對營養匱乏和病原菌等逆境脅迫的抗性反應[11]。寄生雜草獨腳金屬和列當屬植物利用SL促進自身種子萌發并寄生于宿主植物根部,威脅宿主的生存。該類植物可寄生大多數主要糧食作物,在世界范圍內感染了超過6千萬公頃農田,因此導致每年上百億美元的經濟損失,影響世界糧食安全[12]。現已開發出一些SL受體激動劑和拮抗劑用于寄生雜草控制[13～16],其也可用于調節植物株型,通過改善農作物農藝性狀而提高產量[17～19]。此外,SL還可用作植物-微生物共生調節劑,通過促進菌根共生,提高農作物在逆境時的產量。

雖然SL的生物合成、運輸和信號轉導機制已取得了一系列的突破進展[9,20～21],但是SL在調控植物生長發育機制及其與其他激素的交互作用方面還有待進一步研究,可能還有新的未鑒定的SL或有農業價值的類似物,SL化學合成體系也仍需進一步開發完善[22],這些工作都依賴于SL定量檢測方法學的輔助。植物激素在植物體內含量很低(通常約pg/g鮮重),豐度高的其他化合物可能對檢測結果造成顯著干擾,且當這些干擾物與靶標分析物具有相似結構或物化性質時,對檢測結果的影響更大。另外,植物基質的高度復雜性,激素的化學、光和溫度穩定性等也增加了分析的難度。相較于其他植物激素,SL在根部分泌物中或植物體內濃度極低[23]。而且,由于烯醇醚鍵不穩定,SL即使在溫和的環境下也易被剪切或水解[24],在純化過程中很不穩定[25]。因此,植物激素特別是SL的定性和定量分析一直是研究難點。

目前,SL的定量檢測主要依賴氣相色譜(gas chromatography,GC)或高效液相色譜(high-performance liquid chromatography,HPLC)與串聯質譜(tandem mass spectrometry,MS/MS)技術聯用,這些基于譜學的檢測方法具有高準確度和高靈敏度[26～29]。但是,此類方法在很大程度上依賴于中心化的實驗室設備和經驗豐富的操作人員,操作繁瑣、耗時長、價格高,不適用于原位檢測和實時測定[30～32]。另外,雖然快速取樣使色譜分析能夠提供時間分辨率,但是由于提取物反映的是一個器官(如葉片)中眾多細胞的激素濃度平均值,因此無法提供激素水平的空間分辨率,如濃度梯度分布[30]。研發具有較高的靈敏度、特異性和時空分辨率的SL快速檢測方法,對于深入闡明SL感知和信號傳遞機制、調控植物生長發育及對環境變化的響應機制等十分重要。

1 生物傳感器

生物傳感器是一種對特定生物物質敏感,并可將其濃度轉換為定量信號的分析工具或系統。如圖2所示,生物傳感器由生物敏感材料識別器(bioreceptor)、換能器(transducer)和信號讀取系統構成[33]。其中,接受器/識別器需要與換能器具有直接空間連接,而標記物(label)可以被認為是換能器或換能器的一部分。生物傳感器的分類方式較多,主要依據識別元件(如酶、抗體、適配體、分子印跡聚合物等)或者換能器(如電極、熱電偶、光電管等)進行分類。此外,也依據生物傳感器的特性(如微流控)進行分類,或以檢測對象進行分類。

圖2 生物傳感器示意圖MIP:分子印跡聚合物；AuNP:金納米顆粒；MNP:磁性納米顆粒。Fig.2 Schematic representation of a biosensorMIP:Molecular imprinting polymer；AuNP:Au nanoparticle；MNP:Magnetic nanoparticle.

生物傳感器具有操作簡便、響應快速、價格低廉、可選擇性高、可重復性高、穩定、特異性好、線性度高等諸多優點[32～33],為靈敏、特異性定量檢測SL提供了一種新思路。基于上述諸多優點,生物傳感器已被廣泛應用于環境監測、疾病檢測、食品安全、藥物開發等眾多領域[33]。生物傳感器也廣泛應用于小分子如植物激素[34～42]的特異性識別和定量檢測(表 1)。

表1 生物傳感器在植物激素檢測中的應用Table 1 Typical application of biosensors in phytohormone detection

基于酶識別的生物傳感器靈敏度高、特異性強、反應迅速,可以在復雜的生物介質(如細胞裂解液和血液)中直接對靶標進行定量檢測[43]。然而目前只有有限的分析物(如葡萄糖、乙醇、乙酰膽堿)可用作定量檢測體系中酶的底物,且酶對溫度敏感、保質期短,因此酶傳感器在植物激素檢測中的應用較少。另一類常見的生物傳感策略為免疫檢測,即以抗體作為識別元件檢測抗原。抗體可以高親和力地結合特定分析物,在復雜的生物樣本中實現高靈敏度的分析物檢測。但是,抗體制備周期長、費用高、對小分子物質識別能力有限,限制了相關策略在植物激素生物傳感器方面的應用[32]。分子印跡聚合物(molecular imprinting polymer,MIP)也是一種用于生物傳感器的識別元件。MIP是在聚合物材料中引入分子識別位點產生的在空間上與特定模板分子相匹配的、具有高選擇性的高分子化合物。MIP與模板分子的結合類似于抗體-抗原反應。MIP性質穩定,制備過程簡單、可重復性強,但是制備過程毒性較大。近些年來新型的適配體是通過指數富集配基系統進化(systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技術從體外隨機文庫反復篩選獲得的DNA或RNA寡鏈核酸,能夠高親和力、高特異性結合靶標[44]。目前已有數千種適配體被鑒定用于識別蛋白質、多肽、氨基酸、抗生素、小分子化合物、病毒、完整或部分細胞,甚至金屬離子等多種靶標,并應用于診斷、治療、生物傳感器和生物分析領域[45]。適配體篩選周期短、識別靶標范圍廣、批間差小、價格便宜、性質穩定易保存,因此,基于適配體識別的生物傳感器是分析檢測領域目前重要的研究方向之一[32,45～46]。

2 生物傳感器在SL測定中的研究進展

生物傳感器雖然為組織內和胞內快速定量SL提供了新的策略,但目前已開發的高靈敏度、高特異性檢測SL的生物傳感方法十分有限。現已報道的SL生物傳感器都是基于內源性SL的感知機制(圖3),即當SL存在時,SL被受體蛋白D14/DAD2/RMS3(水稻 Oryza sativa DWARF 14,或擬南芥Arabidopsis thaliana DWARF 14,或矮牽牛Petunia hybrida DECREASED APICAL DOMINANCE 2,或豌豆 Pisum sativum RAMOSUS 3)感知,招募下游信號元件F-box蛋白D3/MAX2(水稻DWARF 3,或擬南芥MORE AXILLARY GROWTH 2)和抑制蛋白D53/SMXL[水稻DWARF 53,或擬南芥SUPPRESSOR OF MAX2 1(SMAX1)-LIKE],形成信號轉導蛋白復合體(D3/MAX2-D14/DAD2/RMS3-D53/SMXL)。其中,F-box蛋白家族成員D3/MAX2是SCFD3/MAX2泛素連接酶復合體的底物識別亞基。抑制蛋白D53/SMXL被SCFD3/MAX2泛素化,然后通過26S蛋白酶體降解,從而解除D53/SMXL蛋白對下游轉錄因子及其自身基因啟動子的抑制作用,SL信號從而得以向下游進一步傳遞并發揮生理作用[22,47]。值得一提的是,SL信號也會導致D14/DAD2的降解[22,48]。基于合成生物學理念,研究人員開發了基因編碼的生物傳感器,可間接或直接檢測SL。

圖3 SL信號感知和傳遞機制模型SCF:Skp1-Cullin-F-box；E2:泛素連接酶 2；Ub:泛素；TPR:TOPLESS-related repressor；SPL:Squamosa promoter binding protein-like。已申請獲得該圖[22]的電子/印刷版使用授權。Fig.3 A simplified model of strigolactone perception and signal transductionSCF:Skp1-Cullin-F-box；E2:Ubiquitin ligase 2；Ub:Ubiquitin；TPR:TOPLESS-related repressor；SPL:Squamosa promoter binding protein-like.Reprinted with permission from Reference[22].Copyright 2020 American Chemical Society.

2.1 基于合成生物學的SL間接檢測

起初研究人員基于SL誘導抑制蛋白D53/SMXL6/SMXL7的降解,通過為該類蛋白質添加熒光蛋白標簽,實現了SL的定性檢測。Zhou等[49]在水稻根系中外源添加5 μmol/L rac-GR24(合成的SL類似物),引起了D53-GFP的降解。在擬南芥根系中,5 μmol/L rac-GR24處理也誘導了SMXL6-YFP[50]和SMXL7-YFP[51]的降解。首個基于合成生物學的SL定量檢測是由Samodelov等[52]制備的一種熒光比率式SL生物傳感器(StrigoQuant),該工作構建了REN-2A-SMXL6-FF融合表達體,通過外源添加SL誘導SMXL6-FF降解而導致FF/REN熒光比率下降,從而實現了在擬南芥原生質體內高特異性、高靈敏度的SL定量分析(圖4)。對于rac-GR24、rac-orobanchol和 rac-5-deoxystrigol 3種靶分子,StrigoQuant的檢測限分別為10 pmol/L、10 nmol/L和100 fmol/L,線性范圍約10 pmol/L～1 nmol/L。基于類似理念,Sanchez等[48]開發了一種基因編碼的SL生物傳感器。不同的是,該傳感器是基于SL感知機制引發的受體D14降解,通過SL處理后的轉基因擬南芥D14-FF降解致使熒光信號降低,而實現對SL的定量測定。該傳感體系的半最大效應濃度(50%maximal effective concentration,EC50)為 1.62 μmol/L(rac-GR24),線性范圍為μmol/L級別。相比于StrigoQuant,該傳感器使用了植物自身的D14啟動子來表達D14-FF,而沒有采用外源強啟動子,更接近于植物細胞天然的生理環境,但這可能是其靈敏度低于Strigo-Quant的原因之一[48]。另外,靈敏度低也有可能是由于SMXL6是SCFMAX2的直接靶標,比D14更快發生降解；或者外源添加SL處理原生質體或植株時,SL的吸收、運輸和分布的情況有差別[48]。

圖4 StrigoQuant檢測原理示意圖P35S是組成型35S啟動子；REN是一種綠色熒光素酶,在該傳感體系中作為內參元件；FF是一種黃色熒光素酶；SMXL6是擬南芥中參與SL感知信號通路的抑制蛋白；2A是一種自剪切肽,使該體系的REN和SMXL6-FF能夠按照化學計量比共表達。已申請獲得該圖[52]的電子/印刷版使用授權。Fig.4 Schematic of StrigoQuant biosensor designP35S:A constitutive 35S promoter；REN:A renilla luciferase (green,as a normalization element here)；FF:A firefly luciferase(yellow)；SMXL6:AtSMXL6；2A:A self-processing 2A peptide,leading to stoichiometric coexpression of REN and SMXL6-FF.Reprinted with permission from Reference[52].Copyright 2016 Science Advances.

2.2 基于合成生物學的SL直接檢測

Chesterfield等[22]于2020年開發了另一種熒光比率式生物傳感器,即rDAD2cpGFP和rSh-HTL7cpGFP,是目前已報道的唯一直接定量檢測SL的生物傳感器。該工作(圖5)將cpGFP(circularly permuted green fluorescent protein)與矮牽牛SL受體DAD2或獨腳金(Striga hermonthica)SL受體HTL7整合,使cpGFP可以將外源SL結合其受體引起的構象重排轉化為熒光強度變化。為了克服蛋白質表達量和蛋白質降解等差異造成的影響,該傳感體系引入了一個對SL不敏感的熒光蛋白LSSmOrange作為內參。LSSmOrange融合到DAD2cpGFP和ShHTL7cpGFP的C端。在表達該傳感體系的大腸桿菌裂解液中,rDAD2 cpGFP的EC50為 25.9 nmol/L(rac-GR24)或 70.5 nmol/L(rac-5-deoxystrigol)或 124 nmol/L(rac-orobanchol),線性范圍約為 50～500 nmol/L(rac-GR24)；rShHTL7 cpGFP的EC50為8.9 nmol/L(rac-GR24),線性范圍約為10～100 nmol/L(rac-GR24)。而在煙草原生質體中,rDAD2 cpGFP的EC50為119.3 nmol/L(rac-GR24)。該傳感器體外檢測SL的靈敏度與目前MS檢測限相當:Boutet Mercey等[26]報道使用UHPLCEI-MS/MS分析rac-GR24的檢測限為4.94 μg/L(16.6 nmol/L)。該傳感體系實現了對SL的高特異性、高靈敏性檢測,還可能應用于高通量篩選除草劑(促進寄生雜草自殺性萌發的SL類似物)。相比于現有的其他依賴于SL感知機制的生物傳感器,該SL傳感器首次實現了在體外和植物原生質體內直接定量檢測SL,并且降低了SL感知信號通路中多組分以及D14降解可能涉及未知的基因轉錄過程對檢測結果可能造成的干擾。該工作對于SL的定量檢測研究具有重要意義。

圖5rDAD2 cpGFP檢測原理示意圖SL與受體結合引起的構象變化會使得cpGFP的構象發生重排,導致cpGFP/LSSmOrange熒光比值下降。其中,LSSmOrange對SL不敏感,在此傳感體系中作為內參熒光。已申請獲得該圖[22]的電子/印刷版使用授權。Fig.5 Schematic of the ratiometric DAD2 cPGFP biosensor designThe fluorescence ratio(cpGFP/LSSmOrange)is decreased when strigolactone-induced conformational change is propagated into cpGFP.LSSmOrange,insensitive to strigolactone,is included as an internal flurescent control.Reprinted with permission from Reference[22].Copyright 2020 American Chemical Society.

3 討論與展望

目前已報道的定量檢測SL的生物傳感器都是基于合成生物學方法和內源性SL感知機制,不過它們的靈敏度差異較大。基于SMXL6降解的StrigoQuant具有非常高的靈敏度,可以檢測的濃度低至 10 pmol/L(rac-GR24)、100 fmol/L(rac-5-deoxystrigol)和 10 nmol/L(rac-orobanchol)；基于構象變化的生物傳感器(rDAD2 cpGFP和rShHTL7 cp-GFP)的靈敏度次之,對低-中納摩爾濃度范圍的rac-GR24有明顯的EC50值；而基于D14降解的生物傳感器靈敏度較低,僅對μmol/L濃度范圍的rac-GR24有明顯的EC50值。這些差異可能是由于上述生物傳感器對其他細胞過程的依賴程度不同[22]。比如,在StrigoQuant傳感體系中,帶有熒光素酶標記的SMXL6蛋白被SCFD3/MAX2泛素連接酶復合體泛素化,可能介導其信號放大。相反,SL感知引起D14降解的過程還有待進一步研究,該過程可能抑制檢測信號。而且,不同SL生物傳感器采用的各植物物種的SL受體靈敏度可能有差別,同時生物傳感器構建過程中對受體的修飾或改造而引起的變化各異,這些都可能影響受體對SL的親和力[22]。此外,雖然基于D14降解的SL生物傳感器靈敏度不高,但是構建該傳感器使用的是植物自身的D14啟動子,更接近于植物細胞天然的生理環境。

上述生物傳感器中,只有rDAD2 cpGFP和rShHTL7 cpGFP是直接和定量檢測SL,為測定植物SL濃度和揭示SL信號轉導過程提供了新手段。在已知的識別器中,適配體的3D折疊結構使其可與多種靶標結合形成穩定的復合物,如蛋白質、核酸和小分子等[46]。至今已篩選出數百個適配體適用于識別小分子[32]。相對于抗體,適配體具有顯著的優勢,如可識別低免疫原性的小分子、制備時間短、成本低、批間差小、易修飾、穩定易保存等。因此可以考慮采用適配體作為識別元件,實現體外高特異性、高靈敏度、快速準確地直接測定SL濃度。

為了深入理解SL的生理效應,實時檢測SL的濃度和時空分布具有重要的意義。基因編碼的生物傳感器具有在轉基因植物中特異性定量測定植物激素和無侵入性成像的特點[30],在分析活細胞中植物激素的濃度和分布的動態變化方面具有巨大的潛力。比如,近期Birte H?cker和Gerd Jürgens團隊[53]報道了一種基于FRET的基因編碼生物傳感器(AuxSen),其能夠在細胞和亞細胞水平實時可視化監測生長素的濃度和時空分布,以及生長素對環境變化的響應。AuxSen的構建以大腸桿菌色氨酸抑制蛋白TrpR作為識別元件,經過基因工程改造,使其僅與IAA牢固結合,而不再與TRP結合。使用異源識別元件降低了其干擾植物自身信號通路的可能性[30]。不同于傳統的依賴于內源性生長素響應機制的生長素時空分布研究(如DIIVENUS[54]),AuxSen與生長素的相互作用以可逆的方式誘導FRET比值變化,因此能夠監測生長素濃度的快速瞬時變化。該工作對實時、可視化、原位檢測活體植物體內其他激素的濃度和分布提供了新視角。

此外,SL與其他植物激素在調控植物生長發育過程的交互作用還沒完全闡明。為構建更全面的激素組學信息,未來可以開發同時檢測多種類植物激素的傳感體系,實現多種植物激素的高時空分辨率測定。

目前,性價比高、快速、靈敏、特異性定量檢測SL的生物傳感器有限,今后SL定量檢測的主要趨勢可能仍然以合成生物學方法為主。而適配體生物傳感器由于其在小分子檢測領域獨特的優勢,很可能將進一步推進高靈敏度、高特異性、簡單、快速的SL定量檢測研究。期望不久的將來,可以實現在細胞和亞細胞水平實時、可視化、動態監測SL的濃度和時空分布。SL檢測方法的理論和技術研究,將有助于SL生物合成、運輸、感知和信號傳遞機制的進一步揭示,從而為植物株型和共生特性的定向遺傳改良,以及根際寄生雜草生物/化學防治提供支撐,具有重要科學意義和應用前景。