舒爾經膠囊對原發性痛經模型大鼠下丘腦—垂體—卵巢軸功能的影響及機制研究*

陳貴芹 董 黎 馮 燕 李 娜

河南省人民醫院婦科，河南省鄭州市 450000

原發性痛經(Primary dysmenorrhea，PD)又稱為功能性痛經，指婦女在經期或行經前后，出現周期性下腹疼痛為主癥，伴有其他不適，以致影響工作及生活[1-2]。PD是最常見的婦科疾病之一，據流行病學分析，PD發病率較高，且與不孕關系密切，嚴重影響婦女的生活質量和家庭幸福[3-4]。因此對PD的研究，已成為臨床研究的熱點之一。女性內分泌激素和月經生理周期與下丘腦—垂體—卵巢軸功能關系密切，而下丘腦—垂體—卵巢軸調節女性月經生理周期的作用，已被廣泛研究[5]。非甾體抗炎藥是臨床治療PD常用藥物，但會引起患者胃腸道不適等不良反應，而中醫治療PD具有療效好、毒副作用低等優點而被廣大患者接受，然而中醫藥治療PD的具體作用機制，也是大多學者探究的主要任務[6]。舒爾經膠囊(Shuerjing capsule,SC)由當歸、牡丹皮、赤芍、柴胡、桃仁、陳皮、香附、牛膝、益母草、延胡索、白芍等中草藥組成，有疏肝活血、調經止痛之功效，而被廣泛應用于婦女經前期綜合征、子宮肌瘤、宮腔粘連、氣滯血瘀型痛經等婦科疾病[7-8]。然而SC治療痛經的具體作用機制還不明確，這不利于SC的推廣和被大部分國內外患者認可，故本研究建立大鼠PD模型，探究SC對PD大鼠下丘腦—垂體—卵巢軸功能的影響，以期闡明SC治療PD的作用機制，為臨床合理用藥和中醫藥走向國際化，提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物：健康雌性SPF清潔級SD大鼠(6～7周齡，體重200～220g)購自廣東省醫學實驗動物中心[SCXK(粵)2018-0002]，飼養于本院動物飼養中心。飼養條件：自然光照，自由飲食，溫度25℃，相對濕度50%。本研究經本院動物倫理委員會批準同意，批號為IACUC-01(20160917)。實驗嚴格遵循3R原則。

1.1.2 主要試劑及儀器：舒爾經膠囊(批號：2019030201，購自海南博大制藥廠，規格：0.5g/粒)；布洛芬片(批號：2019020303，購自河北恒利集團制藥股份有限公司，規格：0.1g/片)；己烯雌酚注射液(批號：2018101302，購自上海通用藥業股份有限公司，規格：2mg/支)；卵泡刺激素(FSH)酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(貨號：GD-E007278321，購自上海冠導生物工程有限公司)；黃體生成素(LH)ELISA試劑盒(貨號：JS15421，購自青島捷世康生物科技有限公司)；雌二醇(E2)、β-內啡肽(β-EP)ELISA試劑盒(貨號：E-EL-R0348、E-EL-R0105，購自上海振譽生物科技有限公司)；孕酮(P)、前列腺素E2(PGE2)ELISA試劑盒(貨號：YE01938、YM-DS1604，購自上海遠慕生物科技有限公司)；前列腺素F2α(PGF2α)ELISA試劑盒(貨號：Y102390，購自上海易匯生物科技有限公司)；促性腺激素釋放激素(GnRH)抗體、促性腺激素釋放激素受體(GnRH-R)抗體、卵泡刺激素受體(FSHR) 抗體、促黃體生成素受體(LHR)抗體、雌激素受體(ER)抗體、孕激素受體(PR)抗體及β-EP抗體(貨號分別為：ab189878、ab183079、ab137695、ab267899、ab75901、ab111691、ab167171，均購自美國abcam公司)；BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶(貨號分別為P0768，P0231，均購自美國Pierce 公司)。蛋白電泳儀、半干轉膜儀(型號1659001、Trans-Blot SD，美國Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(型號：GIS-500，Miulab公司)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠PD模型建立及分組給藥：參照文獻[9]構建大鼠PD模型，具體操作方法為：SD雌性大鼠隨機分為正常組(Control)，模型組(PD)，舒爾經膠囊(SC)低(0.15g/kg)、中(0.21g/kg)、高(0.42g/kg)劑量組，布洛芬陽性對照組(陽性組，20mg/kg)，每組10只。除Control組鼠注射生理鹽水外，其余各組大鼠均于皮下注射己烯雌酚注射液，連續 10d，首日和第10天每只大鼠皮下注射 0.5mg己烯雌酚，其他時間每只大鼠每天皮下注射 0.2mg己烯雌酚建立大鼠PD模型。各組大鼠均于第10天注射己烯雌酚注射液后45min，經腹腔注射縮宮素2U/只，觀察大鼠行為，若出現扭體反應(腹部肌肉收縮而內凹，臀部與一側肢體內旋，軀干與后肢伸展)表明造模成功。各組大鼠于造模成功后開始灌胃給藥，SC按成人—大鼠等效劑量換算成大鼠劑量0.15g/kg、0.21g/kg、0.42g/kg(相當于成人等效劑量的1/2、1倍、2倍)，陽性對照組藥物參照文獻[10]進行設置，SC及陽性藥物用生理鹽水分別設置為0.015g/ml、0.021g/ml、0.042g/ml及2.000mg/ml的混懸液，各給藥劑量組均按10ml/kg的體積灌胃給予相應劑量藥物，Control組和PD組灌胃給予等劑量的生理鹽水，各組均連續給藥7d，2次/d。各組大鼠于末次給藥45min后，Control組腹腔注射生理鹽水0.2ml/只，其余各組大鼠腹腔注射縮宮素2U/只，觀察30min 內扭體動物數、扭體次數、計算各組平均扭體次數。

1.2.2 各組大鼠子宮收縮抑制率和子宮指數：各組大鼠檢測完扭體次數后，參照文獻[10]用3%戊巴比妥鈉麻醉，于下腹部正中行5cm切口，取出子宮，在左側子宮角選3cm長一段，將子宮角的陰道端與卵巢端分別縫在塑料“丫”形支架上底的兩端，在子宮兩指點中固定一條棉線，自塑料管引出并連接至傳感器，每組大鼠尾靜脈注射縮宮素0.025U，記錄大鼠子宮平滑肌的活動，檢測結束稱量子宮質量，并計算子宮收縮抑制率及子宮指數。子宮收縮抑制率(%)=(給予縮宮素后數值-給予縮宮素前數值)/給予縮宮素前數值×100%；子宮指數(%)=子宮濕質量/體質量×100%

1.2.3 各組血清FSH、LH、E2、P、PGE2、PGF2α及血漿β-EP含量檢測：各組大鼠在檢測完子宮收縮抑制率和子宮指數后，麻醉處死，迅速取大鼠頸動脈血6ml及下丘腦、垂體、卵巢和子宮組織，將組織迅速置于-80℃冰箱保存備用。血液取其中4ml置于不加抗凝劑的離心管中，靜置，在3 000r/min、10min條件下離心分離后，取血清按放射免疫法試劑盒說明書檢測生殖激素FSH、LH、E2、P含量，用ELISA試劑盒檢測血清PGE2、PGF2α；剩余2ml血液迅速注入含有抑肽酶和乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管中混勻，在3 000r/min、10min條件下離心分離后，取血漿，按放射免疫法試劑盒說明書檢測血漿β-EP含量。

1.2.4 Western blot法檢測下丘腦組織GnRH、垂體組織GnRH-R、卵巢組織FSHR和LHR、子宮內膜組織ER、PR及β-EP蛋白相對表達水平：取1.2.3中-80℃冰箱保存的下丘腦、垂體、卵巢、子宮內膜組織，于4℃冰箱中解凍后，分別用組織勻漿器勻漿，離心分離后取上清液，用蛋白提取試劑盒及BCA試劑盒提取蛋白并檢測蛋白總濃度后，各取50μg蛋白上樣，進行電泳和轉膜反應，TBST溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫封閉1h，TBST清洗3次后，加入一抗[GnRH、GnRH-R、FSHR、ER、PR、β-EP抗體稀釋倍數為1∶1 000，β-actin(內參)稀釋倍數1∶2 000]，4℃孵育過夜，TBST清洗后加入HRP羊抗兔二抗(稀釋倍數1∶2 000]，室溫孵育1h，TBST清洗3次后， 采用增強化學發光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達。

2 結果

2.1 各組大鼠扭體次數、子宮收縮抑制率、子宮指數檢測 與Control組相比，PD組大鼠扭體次數、子宮指數均升高(P<0.05)，子宮收縮抑制率降低(P<0.05)；與PD組相比，SC低、中、高劑量組及陽性組扭體次數、子宮指數均降低(P<0.05)，子宮收縮抑制率均升高(P<0.05)，且SC各劑量組上述指標呈劑量依賴性；與SC高劑量組相比，陽性組上述指標差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠扭體次數、子宮收縮抑制率、子宮指數比較

2.2 各組大鼠血清內分泌生殖激素FSH、LH、E2、P檢測結果 與Control組相比，PD組大鼠血清FSH、LH、E2均升高(P<0.05)，血清P含量降低(P<0.05)；與PD組相比，SC低、中、高劑量組及陽性組大鼠血清FSH、LH、E2均降低(P<0.05)，血清P含量均升高(P<0.05)，SC各劑量組上述指標呈劑量依賴性；與SC高劑量組相比，陽性組上述指標差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠FSH、LH、E2、P含量比較

2.3 各組大鼠血清PGE2、PGF2α及血漿β-EP含量檢測結果 與Control組相比，PD組大鼠血清PGE2、PGF2α及血漿β-EP均升高(P<0.05)；與PD組相比，SC低、中、高劑量組及陽性組大鼠血清PGE2、PGF2α均降低(P<0.05)，血漿β-EP含量均升高(P<0.05)，SC各劑量組上述指標呈劑量依賴性；與SC高劑量組相比，陽性組上述指標差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠PGE2、PGF2α、β-EP含量比較

2.4 各組大鼠下丘腦組織GnRH、垂體組織GnRH-R、卵巢組織FSHR和LHR蛋白表達結果 與Control組相比，PD組大鼠下丘腦組織GnRH、垂體組織GnRH-R、卵巢組織FSHR 和 LHR蛋白表達均升高(P<0.05)。與PD組相比，SC低、中、高劑量組及陽性組大鼠下丘腦組織GnRH、垂體組織GnRH-R、卵巢組織FSHR 和 LHR蛋白表達均降低(P<0.05)，SC各劑量組上述指標呈劑量依賴性。與SC高劑量組相比，陽性組上述指標差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1、表4。

圖1 大鼠下丘腦組織GnRH、垂體組織GnRH-R、卵巢組織FSHR和LHR蛋白免疫印跡圖

表4 各組大鼠組織GnRH、GnRH-R、FSHR、 LHR蛋白表達結果

2.5 各組大鼠子宮內膜組織ER、PR及β-EP蛋白表達結果 與Control組相比，PD組大鼠子宮內膜組織ER、β-EP表達均升高(P<0.05)，PR蛋白表達降低(P<0.05)。與PD組相比，SC低、中、高劑量組及陽性組大鼠子宮內膜組織ER表達降低(P<0.05)，PR及β-EP蛋白表達均升高(P<0.05)，SC各劑量組上述指標呈劑量依賴性。與SC高劑量組相比，陽性組上述指標差異無統計學意義(P>0.05)，見表5、圖2。

表5 各組大鼠子宮內膜組織ER、PR及β-EP蛋白表達結果

圖2 大鼠子宮內膜組織ER、PR及β-EP蛋白表達免疫印跡圖

3 討論

PD雖無生殖器官病理損害，但其發病高、疼痛頻繁，嚴重影響患者的工作和家庭[6]。PD發病機制復雜，西醫認為，PGF2α、PGE2水平異常升高，可引起子宮平滑肌過強收縮和血管痙攣，而導致子宮缺血、缺氧和疼痛，故子宮內膜和血清中PGF2α、PGE2含量異常是造成痛經的決定因素[11-12]，陳志輝[13]發現痛經患者出現血液PGF2α、PGE2升高等子宮收縮異常現象。子宮收縮異常，也可能引起生殖激素FSH、LH、E2、P分泌異常[14]，Dai等[15]發現經前止痛方可通過調節人體FSH、LH、E2、P水平來改善PD患者疼痛癥狀。β-EP具有鎮痛作用，與疼痛和子宮收縮有關[16]，徐莉莉等[17]發現PD模型大鼠子宮組織PGF2α及垂體組織β-EP含量均高于正常組。本研究發現，與Control組相比，PD組大鼠血清PGF2α、PGE2、β-EP含量及內分泌生殖激素FSH、LH、E2含量均增高，P含量降低，而大鼠扭體次數和子宮指數也顯著升高，子宮收縮抑制率降低，提示PD模型大鼠存在子宮收縮異常、生殖內分泌紊亂及疼痛等癥狀，表明造模成功。

目前，西醫尚無理想的治療PD方案，雖然非甾體抗炎類藥和口服避孕藥能在一定程度上緩解PD患者疼痛，但這些藥物不良反應嚴重，而使臨床應用受到限制，中醫認為PD發病因素為寒凝、氣滯、血瘀，且中醫藥在治療PD方面有許多行之有效和獨特的方法[6]。SC來源于我國著名中醫藥專家王綿之教授的臨床驗方,其在治療PD方面有較好的療效[7]，李群等[18]發現舒爾經單一藥物治療原發性痛經, 安全有效, 不良反應少, 值得臨床推廣；張莉等[7]發現SC配合穴位埋線治療氣滯血瘀型PD療效較好，且不良反應少。本研究發現，與PD組相比，SC低、中、高劑量組及陽性組大鼠血清PGF2α、PGE2、FSH、LH、E2含量降低、P及鎮痛分子β-EP升高，大鼠扭體次數和子宮指數顯著降低，子宮收縮抑制率升高，且SC各劑量組呈劑量依賴性，表明SC可改善PD模型大鼠子宮收縮異常、生殖內分泌紊亂及疼痛現象，對PD有較好的療效。但SC治療PD的具體作用機制還不甚明確，本研究對此進行繼續研究，為SC的推廣應用和走向國際化提供實驗依據，具有一定的臨床研究價值。近來研究發現，壓力、情志、環境等應激作用可刺激下丘腦—垂體—卵巢軸功能，影響女性生殖激素分泌[19-20]，而中醫認為，情志失調，寒凝、氣滯是導致PD發生的主要原因，故下丘腦—垂體—卵巢軸等功能失調也可能參與PD發病過程。垂體激素(Gn-RH、FSH和LH)和卵巢激素(E2和P)是導致痛經性風濕性神經內分泌功能障礙的主要原因之一[15]，E2可引起下丘腦GnRH脈沖功能亢進的分泌，使垂體分泌過多的FSH和LH，而升高的LH又可刺激卵巢產生過量的E2和P，E2和P不僅可與子宮內膜ER和PR受體結合，影響子宮生理功能，還可進一步引起下丘腦GnRH脈沖功能持續亢進，從而引起惡性病理循環[21]。劉芳等[22]發現，針刺治療PD后，大鼠下丘腦、垂體、卵巢組織中β-EP表達增高，下丘腦GnRH分泌及垂體、卵巢組織相關受體表達及痛經現象均減少，證明針刺可能通過增加下丘腦—垂體—卵巢軸中β-EP分泌，從而抑制GnRH、GnRH-R、FSH、LH、E2、ER產生的增加以及P、PR產生的減少，并抑制下丘腦—垂體—卵巢功能激活來實現治療PD 的目的。本研究發現，與Control組相比，PD組大鼠下丘腦組織中GnRH、垂體組織中GnRH-R、卵巢組織中FSHR及LHR蛋白表達均增高、子宮內膜ER、β-EP增高，而子宮組織PR減少，提示血清E2及子宮組織ER升高，可能引起了下丘腦—垂體—卵巢功能亢進，使生殖內分泌激素紊亂，而子宮疼痛應激而產生鎮痛物質β-EP，推測可能分泌的β-EP不足以抑制E2升高引起的下丘腦—垂體—卵巢功能激活。而與PD組相比，SC低、中、高劑量組及陽性組大鼠血清E2含量減少，子宮內膜組織β-EP增加，而下丘腦—垂體—卵巢軸組織及相關受體GnRH、GnRH-R、FSHR、LHR、ER表達也均降低，且上述指標呈劑量依賴性改善，推測SC藥物作用可能增加β-EP表達并降低E2分泌，抑制了丘腦—垂體—卵巢功能亢進，改善激素分泌紊亂現象，從而改善大鼠疼痛現象。

綜上所述，SC可抑制下丘腦—垂體—卵巢軸功能激活，改善PD大鼠生殖內分泌激素紊亂和疼痛現象，可能為臨床治療PD提供一定參考。但本研究還存在一定的不足，丘腦—垂體—卵巢軸功能調節內分泌生殖機制復雜，SC還可能通過其他途徑影響下丘腦—垂體—卵巢軸功能，改善PD患者生殖內分泌激素紊亂和疼痛現象，這有待后續進一步驗證和探究。