葵花籽蛋白脫色工藝優化及功能特性研究

秦那日蘇 包小蘭

(內蒙古農業大學食品科學與工程學院，呼和浩特 010018)

葵花籽是世界上四大主要油料種子之一[1]。葵花籽粕是葵花籽制油后的副產物，營養物質豐富，其蛋白質質量分數達29%～43%[2]，抗營養化合物含量低且不含有毒物質，因此是一種極好的蛋白質來源[3]。然而，葵花籽蛋白的應用仍然局限于動物飼料，盡管葵花籽蛋白的功能特性被證明與大豆和其他豆類的蛋白相當[4]。一個主要的原因是葵花籽中含有酚類化合物，它們很容易在傳統的堿性蛋白質提取過程中被氧化導致蛋白質變成墨綠色或灰色，不僅顏色很難讓消費者接受，而且還會降低蛋白的營養價值和功能特性[5，6]。

目前國內外對葵花籽蛋白的脫色方法主要有活性炭吸附法[7，8]、有機溶劑萃取法[9]、雙氧水氧化法[10，11]及大孔樹脂吸附法[12]。大孔樹脂吸附法具有選擇性好、吸附容量大、樹脂易再生、環保及蛋白損失率低等優點[13]。Pickardt等[5]在酸性條件下通過XAD-16 大孔樹脂吸附來提取低多酚葵花籽蛋白，發現大孔樹脂吸附處理后脫色效果顯著，其白度值(L*)為77.3，而且功能性質也有所提高。為了提升植物蛋白的營養價值和功能性質，目前多數通過酶法改性來實現，酶解能夠正向修飾蛋白質，可以破壞特定的肽鍵，從而改變蛋白質的結構，酶解法的優點是pH和溫度條件溫和、反應副產物少、特異性高，易控制，安全等優點，從而改善蛋白質的提取率和功能性質。近年來，人們通過酶解結合吸附劑來提取植物蛋白或多糖，發現這個方法不僅可以提高功能性質，還對脫色效果具有顯著的影響。鄒東恢[14]使用纖維素酶和木瓜蛋白酶的混合酶結合活性炭吸附來提取枸杞多糖，發現提取出來的枸杞多糖脫色效果顯著，脫色率為72.4%。張曉平等[15]利用堿性蛋白酶結合YD-303活性炭吸附來提取脫色燕麥蛋白，發現在最佳工藝條件下燕麥蛋白的脫色率高達85.36%。

本研究旨在通過限制性酶解后再結合大孔樹脂進行吸附處理來提取葵花籽蛋白，促進葵花籽粕在人體營養方面的應用，同時分離出酚類化合物的來提高整個工藝的經濟性，以期獲得感官特性和功能特性都較好的葵花籽蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂葵花籽粕;AB-8、DA01和DA201型大孔樹脂;堿性蛋白酶(Alcalase 2.4L)、風味蛋白酶(Flavourzyme500 MG)、中性蛋白酶(Neutrase 1.5MG);所用化學試劑均為分析純，用蒸餾水制備所有溶液。

1.2 儀器與設備

LCJ-25C型冷凍干燥機，CR-10型色差計，K116型凱氏定氮儀，UV-2300型紫外分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 葵花籽蛋白的制備

稱取低溫脫脂葵花籽粉50 g，加500 mL無水乙醇1∶10 (g/mL)混合攪拌均勻，在25 ℃恒溫水浴鍋中攪拌1 h，離心(4 000 r/min，15 min)，取沉淀加750 mL (15倍)蒸餾水攪拌均勻，用0.1 mol/L NaOH調節pH 7.0，在50 ℃恒溫水浴鍋中攪拌1 h，離心(4 000 r/min，15 min)，取上清液，用0.1 mol/L HCl調pH至4.0進行蛋白酸沉，離心(4 000 r/min，15 min)取沉淀，沉淀水洗3次，收集沉淀用0.1 mol/L NaOH調pH至7.0，冷凍干燥保存備用。

1.3.2 大孔樹脂吸附脫色葵花籽蛋白的制備

稱取低溫脫脂葵花籽粉50 g，加500 mL 1.3 mol/L的氯化鈉溶液(1∶10，g/mL)混合攪拌均勻，用0.1 mol/L NaOH調節溶液pH至6.0，然后在25 ℃恒溫水浴鍋中攪拌1h，離心(4 000 r/min，15 min)收集上清液，用0.1 mol/L NaOH調節溶液pH至7.0，用AB-8型、D101和DA201大孔樹脂進行吸附(10%大孔樹脂，120 min)，過濾樹脂收集上清液，用0.1 mol/L HCl調節pH至3.8酸沉，離心(4 000 r/min，15 min)取沉淀，用蒸餾水將沉淀水洗3次，用0.1 mol/L NaOH調節溶液pH至7.0，冷凍干燥保存備用。

1.3.3 限制性酶解結合大孔樹脂吸附脫色葵花籽蛋白的制備

稱取低溫脫脂葵花籽粉50 g，加500 mL 1.3 mol/L的氯化鈉溶液(1∶10，g/mL)混合攪拌均勻，用0.1 mol/L NaOH調節溶液pH至6.0，然后在25 ℃恒溫水浴鍋中攪拌1 h，離心(4 000 r/min，15 min)收集上清液，加堿性、中性和風味蛋白酶限制性酶解10 min (1%酶添加量，最適酶解 pH和溫度)，用0.1 mol/L NaOH調節溶液pH至7.0，用AB-8型、D101和DA201大孔樹脂進行吸附(10%大孔樹脂，120 min)，過濾樹脂收集上清液，用0.1 mol/L HCl調節pH至3.8酸沉，離心(4 000 r/min，15 min)取沉淀，用蒸餾水將沉淀水洗3次，用0.1 mol/L NaOH調節溶液pH至7.0，冷凍干燥保存備用。

1.3.4 葵花籽蛋白色澤的測定

采用CR-10色差儀進行葵花籽蛋白色澤的測定，首先進行黑白板自動校正，自動校正完成后進入標準測量界面，按測試鍵，讀出標準樣的L*、a*、b*值，進行樣品色澤的測定(取3次平均值)。

1.3.5 葵花籽蛋白得率及含量的測定

含量與得率的測定:蛋白質含量測定采用凱氏定氮法。

式中:m1為提取蛋白質質量/g；m0為葵花籽粕粉質量/g。

1.3.6 單因素實驗設計

以L*值作為評價指標，分別對pH(5、6、7、8、9)，加酶量(0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)、酶解時間(0、5、10、15、20 min)、酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)進行單因素實驗，以確定各因素的適宜范圍和影響效果。

1.3.7 正交優化實驗

在單因素實驗的基礎上，選擇酶解溫度、酶解pH、酶解時間、酶添加量為影響因素，固定料液比為1∶10(g/mL)，pH為6.0，使用色差計測定葵花籽蛋白的白度值(L*值)，以葵花籽蛋白質白度值(L*)為評價指標進行正交工藝參數優化實驗，并確定四因素三水平的最佳參數進行正交設計分析，實驗因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平表

1.4 溶解性的測定

根據Bera等[16]的方法并稍作修改測定葵花籽蛋白的溶解度，用蒸餾水配制1 g/mL的蛋白樣品溶液，用0.1 mol/L HCl或NaOH調pH為7，室溫攪拌1 h后，離心(4 000 r/min，15 min),利用凱式定氮儀測定蛋白質含量。通過公式計算：

1.5 起泡性及泡沫穩定性的測定

參照 Motoi等[17]的方法并做一定調整，用蒸餾水配制1 g/mL的蛋白質樣品溶液。取50 mL置于高速組織攪拌機內，以12 000 r/min的轉速攪打2 min。記錄泡沫體積，靜置30 min后，再次記錄泡沫體積。起泡性(FC)及泡沫穩定性(FS)通過公式計算：

式中:V0是攪打剛停止時泡沫體積/mL；VL是樣品溶液體積/mL；V30是靜置30 min后的泡沫體積/mL。

1.6 乳化性及乳化穩定性的測定

用Yust等[18]的方法來測定乳化性及乳化穩定性，用蒸餾水配制濃度為1 mg/mL的蛋白樣品溶液，將15 mL蛋白質溶液與5 mL大豆油(3∶1)攪拌混合，在12 000 r/min的條件下均質2 min，分別在0 min (A0)和靜置10 min (A10)后從容器底部取50 μL乳濁液，與5 mL(0.1%，g/mL)的SDS溶液混合均勻，用紫外分光光度計在波長500 nm處測定吸光度值。使用公式計算乳化性(EAI)和乳化穩定性(ESI)：

式中:Φ為0.01；θ為溶液中油的體積分數(0.25)；C為樣品的溶液質量濃度/g/mL。

1.7 持油性及持水性的測定

根據Wani等[19]方法測定持油性及持水性，稱取0.5 g 樣品(m0)置于 50 mL 離心管中，稱重(m1)，加入10 mL大豆油(水)，漩渦振動 5 min使其混合均勻，室溫下靜置30 min后，4 000 r/min離心30 min，移除上清大豆油(水)，再稱重(m2)。持油性/持水性(mL/g)計算公式為：

持油性/持水性=(m2-m1)/m0×100

式中:m0為蛋白質量/g；m1為離心管質量/g；m2為去掉上清液后的離心管質量/g。

1.8 數據處理

實驗均重復3次，結果以平均值±標準差表示，試驗數據采用SPSS 16.0統計軟件里的方差分析(ANOVA) 進行兩組間的數據分析，P<0.05表示兩組之間具有顯著性差異，采用 Origin 2017作圖。

2 結果與分析

2.1 不同類型蛋白酶結合大孔樹脂吸附對葵花籽蛋白脫色效果的影響

選擇堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶限制性酶解10 min(最適pH及溫度)結合D101型大孔樹脂、AB-8型大孔樹脂及DA201型大孔樹脂(10%大孔樹脂，吸附120 min)吸附處理對葵花籽蛋白脫色效果的影響，不同類型蛋白酶結合大孔樹脂吸附對葵花籽蛋白脫色效果的影響見表2。

表2 不同類型蛋白酶結合大孔樹脂吸附對葵花籽蛋白脫色效果的影響

由表2可知，未脫色葵花籽蛋白白度值(L*)為55.7，呈深灰色；經不同類型的大孔樹脂吸附處理后脫色效果顯著，蛋白顏色均有不同程度的改善，其中AB-8型大孔樹脂吸附脫色葵花籽蛋白的L*值最高，為72.2，先通過不同蛋白酶進行限制性酶解再結合大孔樹脂吸附處理后發現具有更好的脫色效果，堿性蛋白酶限制性酶解后再結合AB-8型大孔樹脂的吸附處理的脫色效果最好，其白度值最高為80.8，與其他蛋白酶和大孔樹脂相比具有顯著性差異(P<0.05)，表明限制性酶解后再結合大孔樹脂吸附對葵花籽蛋白脫色效果具有顯著的影響。因此選用堿性蛋白酶限制性酶解結合AB-8型大孔樹脂處理進行下一步工藝優化實驗。

2.2 單因素條件對葵花籽蛋白脫色效果的影響

2.2.1 酶解溫度對葵花籽蛋白脫色效果的影響

在pH為7.0、酶解時間為10 min和酶添加量為1.0%的固定條件下，改變酶解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃，探討酶解溫度對葵花籽蛋白脫色效果的影響，其結果如圖1所示。酶解溫度從40 ℃升高至50 ℃過程中，葵花籽蛋白L*值呈現先下降后上升的趨勢，在酶解溫度為50 ℃時白度值L*達到最高，這是由于適宜的溫度可以增加蛋白質在水中的溶解度，而且溫度的升高在一定程度上有利于大孔樹脂的吸附作用，從而促使葵花籽蛋白的白度值(L*)升高。隨著酶解溫度的升高，蛋白白度值發生驟降，這是由于蛋白質對溫度敏感，過高的溫度可使其發生變性，繼續升高溫度不利于酶作用的最適條件以及蛋白凝膠的穩定性，故選擇酶解溫度為50 ℃。

圖1 不同處理對葵花籽蛋白脫色效果的影響

2.2.2 酶解pH對葵花籽分離蛋白脫色效果的影響

在酶解溫度為50 ℃、酶解時間為10 min和酶添加量為1.0%的固定條件下，改變pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，探討pH對葵花籽蛋白脫色效果的影響，其結果如圖1所示。在pH 5.0～6.0之間，葵花籽粕蛋白質白度值(L*)不斷提高，因此一定的pH值有利于葵花好柏蛋白質提取，在其他條件保持不變的情況下，在酶解 pH為6.0的時候葵花籽蛋白的白度值(L*)達到最高，但隨著pH的增大，葵花籽蛋白質的L*值開始持續下降，脫色效果降低，因為當pH接處于等電點附近時，溶液中存在大量蛋白顆粒，不利于蛋白酶作用；當pH遠離等電點時，葵花蛋白分子所帶有的同種電荷量增多，分子間的主要作用力為靜電排斥力，而蛋白質被酶解后，會暴露出部分疏水基團，其與靜電斥力產生相互吸引。當pH為6.0時白度值L*達到最大值，說明在此條件下，大孔樹脂對蛋白的吸附作用最為適宜，故選擇pH為6.0。

2.2.3 酶解時間對葵花籽蛋白脫色效果的影響

在酶解溫度為50 ℃、pH為7.0和酶添加量為1.0%的固定條件下，改變酶解時間分別為0、5、10、15、20 min，探討酶解時間對葵花籽蛋白脫色效果的影響，其結果如圖1所示。酶解時間對葵花籽蛋白的L*值的影響顯著，酶解時間從0～10 min過程中，隨酶解時間的延長葵花籽蛋白的L*值由72.2提高至80.9，提高幅度較大，10 min之后，葵花籽蛋白的L*值隨時間的延長呈下降趨勢，分析原因認為，利用限制性酶解葵花籽蛋白打斷部分肽鍵，暴露出適量的疏水性氨基酸殘基，從而提供大孔樹脂更深層次的吸附，但若水解過度則會將蛋白質降解為短肽，不利于大孔樹脂的吸附作用，故選擇酶解時間為10 min。

2.2.4 加酶量對葵花籽蛋白脫色效果的影響

在酶解溫度為50 ℃、酶解時間為10 min和pH為7.0的固定條件下，改變加酶量分別為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，探討加酶量對葵花籽蛋白脫色效果的影響，其結果如圖1所示。由圖1可知，在加酶量0.6%～0.8%之間，葵花籽蛋白的L*值不斷提高，加酶量為0.8%的時候葵花籽蛋白的L*值達到最高，因此一定的酶添加量有利于脫除綠原酸從而改善葵花籽蛋白質的顏色，在其他條件保持不變的情況下，隨著酶添加量的增加，葵花蛋白L*值呈急速下降趨勢，脫色效果降低，故選擇加酶量為0.8%。

2.3 正交實驗結果分析

在單因素實驗的結果分析基礎上，選擇酶解溫度、pH、酶解時間、加酶量為考察因素，以白度值(L*)為考察指標，進行正交實驗，正交實驗方案設計及結果分析表見表3。從表3中比較極差R值大小可知，影響葵花籽蛋白脫色效果的各因素主次順序分別為B(酶解時間)>A(pH值)>C(酶解溫度)>D(加酶量)。通過正交實驗得到最佳脫色工藝條件為：酶解時間10 min、酶解pH 6.0、酶解溫度55 ℃、酶添加量0.8%，在此條件下葵花籽蛋白的L*值為84.5、a*值2.7、b*值12.6。

表3 正交試驗方案設計及結果分析表

2.4 限制性酶解結合大孔樹脂吸附脫色對葵花籽蛋白得率及含量的影響

葵花籽蛋白和限制性酶解結合大孔樹脂吸附脫色葵花籽蛋白的得率及蛋白質含量見表4，由表4可知，與葵花籽蛋白相比，限制性酶解結合大孔樹脂吸附脫色的葵花籽蛋白的得率和蛋白質含量都明顯提高，這可能是由于一方面限制性酶解之后導致蛋白結構發生改變，結構伸展，疏水基團暴露，加快了溶劑的滲透效率，從而提高了蛋白質得率。另一方面，適宜的pH和NaCl濃度會降低蛋白和多酚類物質的氧化作用，從而提高蛋白產量。Pickardt等[14]在pH 6和1.3 mol/L NaCl條件下采用XAD-16大孔樹脂進行吸附條件下提取低酚葵花籽蛋白，發現不僅可以改善葵花籽蛋白顏色，還能有效提高蛋白得率。

表4 限制性酶解結合大孔樹脂吸附脫色對葵花籽蛋白得率及含量的影響

2.5 限制性酶解結合大孔樹脂吸附脫色對葵花籽蛋白功能特性的影響

溶解性、乳化性及乳化穩定性、起泡性及泡沫穩定性和持油性及持水性都是蛋白質重要的功能特性，在焙烤食品、飲料及肉制品等食品工業中具有重要作用，葵花籽蛋白和限制性酶解結合大孔樹脂吸附脫色葵花籽蛋白的功能特性見表5。

由表5可知，與未脫色葵花籽蛋白相比，限制性酶解結合大孔樹脂吸附脫色對葵花籽蛋白的溶解性、乳化性及乳化穩定性、起泡性和持水性都顯著提高(P<0.05)，這可能是由于限制性酶解后蛋白質的結構發生伸展，分子量降低，蛋白質更容易在界面擴散，界面的吸附能力加強，使得疏水性基團具有親水親油性，所以蛋白的溶解性、乳化性及乳化穩定性、起泡性和持水性都增強了，限制性酶解結合大孔樹脂吸附脫色葵花籽蛋白的持油性及泡沫穩定性略低于未脫色葵花籽蛋白，這可能是由于限制性酶解產生的小肽不足以維持泡沫的穩定，導致酶解產物的泡沫穩定性降低了，另一方面由于限制性酶解破壞了蛋白原有的結構，減弱了其物理包覆能力，蛋白的吸附能力降低，最終導致持油性降低。Jin等[20]使用胰蛋白酶對核桃蛋白進行限制性酶解后發現其溶解性、乳化性、起泡性均顯著提高。限制性酶解結合大孔樹脂吸附脫色處理可以提高葵花籽蛋白的功能特性。

表5 限制性酶解結合大孔樹脂吸附脫色對葵花籽蛋白功能特性的影響

3 結論

在單因素實驗基礎上進行四因素三水平的正交實驗分析，優化葵花籽分離蛋白的脫色工藝條件，正交試驗分析得出：限制性酶解結合大孔樹脂吸附脫色的最佳工藝參數為酶解時間10 min、酶解pH 6.0、酶解溫度55 ℃、酶添加量0.8%。在此條件下葵花籽蛋白的白度值(L*)為84.5、a*值2.7、b*值12.6，蛋白質質量分數和得率分別為(97.65±0.23)%和(7.22±0.02)%，葵花籽蛋白顏色由深灰色變為淺白色，脫色效果顯著。限制性酶解結合大孔樹脂吸附脫色葵花籽蛋白的溶解度、起泡性及起泡穩定性和乳化性及乳化穩定性均得到顯著提高(P<0.05)，持油性和泡沫穩定性降低，限制性酶解結合大孔樹脂吸附不僅對葵花籽蛋白脫色具有顯著效果，還對葵花籽蛋白的功能特性的提升有顯著的影響。該工藝可以促進葵花籽粕加工的開發，滿足食品工業在尋找大豆蛋白以外的優質植物蛋白方面的要求。