木薯根域AMF群落結構特征及多樣性研究

周時藝，韋云東，陳蕊蕊，鄭華，李軍，盤歡，羅燕春

摘 要：土壤微生物是土壤—作物系統養分循環的重要驅動力，其中叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）能夠促進作物對養分的吸收。木薯是我國南方重要的經濟作物，是多種行業的重要原材料。為揭示不同土壤質地木薯根域土壤AMF群落結構特征，解析土壤因子對AMF類群的影響。以木薯品種華南205（SC205）為材料，通過田間根袋培養，利用高通量測序平臺進行真菌擴增子測序，分析不同處理木薯根域AMF類群組成和多樣性差異。結果表明，木薯根域土壤AMF主要為球囊霉屬（Glomus）、無梗囊霉屬（Acaulospora）、盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）、類球囊霉屬（Paraglomus）和雙型囊霉屬（Ambispora）。優勢屬為球囊霉屬和無梗囊霉屬。兩種土質各處理AMF屬水平上無顯著差異，種水平分布受土壤質地及根袋的影響，粘土AMF多樣性（Simpson指數）高于砂質壤土。兩種土質中都發現獨有種，土壤質地對木薯根域AMF群落分布有一定的影響。RDA分析表明Glomus與速效磷、速效氮、銨態氮正相關;Acaulospora與速效磷，速效氮弱負相關;Scutellospora與所有速效養分負相關;Paraglomus與所有速效養分表現出正相關;Ambispora與大部分速效養分表現出負相關。木薯根域AMF資源豐富，不同土壤質地條件下的AMF群落組成和豐度存在差異，土壤速效養分與AMF群落結構差異密切相關。該研究為進一步探索AMF在木薯上的應用提供理論參考。

關鍵詞：木薯;叢枝菌根真菌;高通量測序;球囊霉屬;多樣性

中圖分類號：S154.3，S533? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A

Study on the Structural Characteristics and Diversity of AMF Community in Cassava Root Zone

ZHOU Shiyi，WEI Yundong，CHEN Ruirui，ZHENG Hua，LI Jun，

PAN Huan，LUO Yanchun

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute，Nanning， Guangxi 530001，China）

Abstract： Soil microorganism is an important driving force of nutrient cycling in soil-crop system， and arbuscular mycorrhizal fungi （AMF） can increase the nutrient absorption of crops. Cassava is an important cash crop in the south of China， and it is an important raw material for many industries. In order to reveal the AMF community structure characteristics in cassava root zone with different soil textures and analyze the effects of soil factors on AMF groups， a root-bag experiment was set with cassava variety SC205 as material. We analyzed the composition and diversity of AMF groups in the cassava root zone under different treatments via high-throughput sequencing. The results showed that the main AMF of cassava root soil were Glomus，Acaulospora，Scutellospora，Paraglomus and Ambispora， and the dominant groups were Glomus and Acaulospora. There was no significant difference at AMF genera level between two soil treatments. The distribution of species level was affected by soil texture and root-bag， and Simpson index of clay was higher than sandy loam. Unique species were found in both soils， and soil texture had a certain influence on the distribution of AMF community in cassava root zone. RDA analysis showed that Glomus was positively correlated with available P， available N and ammonium N; Acaulospora was negatively correlated with available P and available N; Scutellospora was negatively correlated with all available nutrients; Paraglomus was positively correlated with all available nutrients. Ambispora was negatively correlated with most available nutrients. The cassava root zone soil is rich in AMF resources， the AMF community composition and abundance differed in different soil textures， and soil available nutrients and soil structure are closely related to AMF community. This study provides a theoretical reference for further exploration of AMF application in cassava production.

Key words： Cassava; arbuscular mycorrhizal fungi; high-throughput sequencing; Glomus; diversity

根際作為植物根系與土壤緊密接觸且相互影響的微生態環境，是植物—土壤進行物質能量交換的重要場所，其豐富的微生物種群是反應土壤健康狀態的重要指標[1]，對調節土壤肥力有著重要的作用。植物類型[2-3]和土壤類型[4]是影響根際微生物群的重要因素。

叢枝菌根真菌（Arbuscular Mycorrhiza Fungi，AMF）是自然生態系統中廣泛存在的一類真菌，它能定殖于絕大多數高等植物根系并與其根系形成互惠共生體，即AM菌根。AM菌根能促進寄主植物對水分和礦質營養元素的吸收，提高植物在干旱、缺磷等生物和非生物脅迫下的生存能力，促進植物生長。研究表明，叢枝菌根育苗可提高西瓜根際酸性磷酸酶活性而改善磷營養，提高植株抗病能力，降低枯萎病發病率和發病指數[5]。在磷養分缺乏的土壤中接種AMF能使玉米增產20%以上、菜豆增產30%以上，西瓜產量和品質明顯提高[6]。盧李威等[7]發現施AM菌劑能促進甘蔗對土壤中鎂和有機質的吸收，提高磷肥的利用率。接種摩西球囊霉（G. mosseae）可顯著提高柑橘根際土壤有效磷含量[8]。植被類型、土壤質地類型、土壤養分、地理距離等環境變量對AMF的群落結構組成，多樣性都有顯著影響[9-12]。

木薯是世界三大薯類作物之一，有著“地下糧倉”、“淀粉之王”的美譽，是我國南方紅壤區重要經濟作物，是食品、飼料、生物燃料等多種行業的重要原料。木薯是典型AMF依賴型作物[13]，接種AMF可顯著提高木薯鮮薯產量[14]。李冬萍等[15]發現，木薯“GR911”施用AM菌劑平均產量可達45.54 t/hm2，比對照增產19.8%。鄭華等[16]發現，緩釋肥配施AM菌劑可顯著提高木薯產量。關于木薯根域土壤AMF群落結構特征及種群多樣性少見報道。

本研究采用根袋法[17]，設置兩種不同質地土壤，及根袋內不同土壤重量，測定土壤速效養分和土壤AMF類群結構組成及多樣性，分析不同處理條件下木薯根域土壤AMF群落結構特征差異，為深入認知木薯根際微生態，進而為AMF在木薯生長調節上的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試木薯品種為華南205（SC205），參試土壤質地分別為粘土和砂質壤土。根袋材質為300目尼龍網，分大袋和小袋。大袋為50 cm×30 cm×15 cm的長方體，上部中間有長13cm，高7 cm的一條開口，方便放入小袋。小袋為長30 cm，直徑5 cm，正中間有高10 cm，直徑5 cm的T型凸起，凸起上下均開口，用于種植木薯種莖。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

試驗采用大袋套小袋的根袋法[17]，種植時先將參試土壤與肥料混勻，大袋裝滿（粘土22.5 kg，砂質壤土25.0 kg）并埋入田間地下10 cm，小袋按處理內置不同重量和質地參試土壤，置入大袋中。試驗共10個處理（表1），每個處理4個重復。

1.2.2 采樣與測試方法

種植120 d后采集土壤樣品，挑選處理1、3、5、6、7、9處理根袋內土樣24個及兩種土質各4個根袋外土樣，共32個土樣進行土壤速效養分測試和AMF多樣性高通量測序。土壤速效養分測定方法參照《土壤農化分析》[18]。AMF多樣性高通量測序，包括DNA提取和PCR擴增、測序、數據處理等過程，與Li等[19]程序一致，由Illumina Hiseq 2500平臺進行測序，18S_AMF區域引物為AMV4.5NF（5'-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3'）和AMDGR（5'-CCCAACTATCCCTATTAATCAT - 3'）引物對的ITS1可變區進行PCR擴增。擴增程序為：95 ℃預變性5 min，35個循環（95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s），最后72 ℃延伸7 min。

1.2.3 數據統計分析

土壤速效養分數據采用Microsoft office/Excel 2010進行統計分析，方差分析采用RStudio version 1.1.463（基于R Version 3.5.2）中的ANOVA進行，多重比較采用SSR法;非參數秩和檢驗用boxplerk.R函數完成，采用bonferroni holm方法校正P值。

2 結果與分析

2.1 土壤AMF群落結構及多樣性

AMF測序中，32個樣品測序共獲得 2，550，239對Reads，雙端Reads拼接、過濾后共產生2，446，666條Clean tags，平均每個樣品產生76，458條Clean tags。不同處理的AMF主要分布在球囊霉屬（Glomus）、無梗囊霉屬（Acaulospora）、盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）、類球囊霉屬（Paraglomus）和雙型囊霉屬（Ambispora）。

粘土各處理可確定的AMF物種數量有14～17個。相比其它處理，粘土根袋外（Claysoil）發現4個獨有種，分別為Glomus sp.Alguacil09b、Glomus sp.VTX00222、Glomus sp.VTX00319、Glomus sp.VTX00419，有效tags數在669～1243之間;根袋內獨有種Glomus sp. VTX00227、Glomus sp. Kluber12、Glomus sp.VTX00310、Paraglomus sp.VTX00308。說明這些種對粘土具有高度專一性。砂質壤土各處理可確定的AMF物種數量在14～16個。砂質壤土獨有種包括Glomus sp.Glo-E VTX00319、Glomus sp.VTX00085、Acaulospora sp.VTX00242、Acaulospora. sp.VTX00026、Paraglomus sp.VTX00375，有效tags數在118～8218之間。根袋外（Sandsoil）有兩個特有種：Glomus.Glo-E VTX00319、Glomus sp.VTX00085，Glomus sp.VTX00099在Sand100中大量繁殖，其有效tags達到18489個;Glomus sp.VTX00120僅在Sand200中出現。

粘土處理根袋內外共有的可注釋AMF有12種，包括：Acaulospora sp.VTX00024、S.LH-Sc01、Scutellospora sp.VTX00041、G.clarum、Glomus sp.VTX00090、Glomus sp.VTX00248、Glomus sp.VTX00270、Glomus sp.VTX00280、Glomus sp.VTX00362、Glomus sp.VTX00399、Glomus sp.VTX00403、Paraglomus sp.VTX00238。而砂質壤土中還發現Acaulospora sp.VTX00026。

由圖1可見，粘土不同處理的AMF主要為球囊霉屬（Glomus）、無梗囊霉屬（Acaulospora）、盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）和類球囊霉屬（Paraglomus）。其中球囊霉屬的相對豐度范圍為76.18%～82.75%，扣除無法注釋的種（45.41%～57.70%），可注釋的球囊霉屬豐度范圍為18.10%～31.97%;無梗囊霉屬的相對豐度范圍為2.78%～9.36%;盾巨孢囊霉屬的范圍為0.31%～10.14%;類球囊霉屬相對豐度較小，范圍在0.48%～0.71%。

砂質壤土各處理AMF主要分布在球囊霉屬（Glomus）、無梗囊霉屬（Acaulospora）、盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）、類球囊霉屬（Paraglomus）和雙型囊霉屬（Ambispora）。其中球囊霉屬的相對豐度范圍為29.61%～49.72%，可注釋的球囊霉屬豐度范圍為18.10%～31.97%;無梗囊霉屬的相對豐度范圍為14.18～28.82%;盾巨孢囊霉屬范圍為5.42%～17.20%;類球囊霉屬和雙型囊霉屬相對豐度較小，范圍分別在0.01%～0.58%和0.02%～0.19%之間。

α多樣性用于反映樣品物種豐度及多樣性，多樣性指標包括Shannon指數、Simpson指數、均勻度指數ACE和豐富度指數Chao1。由表2可知，各處理均勻度指數ACE指數無顯著差異。Shannon指數顯示為同種土質內不同處理無顯著差異，不同土質間表現為Sandsoil和Sand400顯著高于Clay300和Clay500。Simpson指數也表現為同種土質無顯著差異，但不同土質間表現為Clay300和Clay500顯著高于Sandsoil和Sand400。豐富度指數Chao1表現為粘土各處理間無顯著差異;Sandsoil顯著大于Sand400，且顯著大于Clay300。

由PERMANOVA檢驗（表3）可以看出，AMF的種間差異主要表現在兩種土壤質地之間，包括Claysoil與Sandsoil、兩種土壤的根袋內樣品，Clay100與Claysoil、Clay100與Sand100之間差異顯著，但Sand100與Sandsoil差異不顯著。

2.2 土壤速效養分與AMF相關性分析

AMF屬相對豐度與土壤速效養分之間的RDA分析結果表明，土壤速效養分各指標對土壤AMF的總方差的解釋率為55.95%，其中第一典范軸（RDA1）和第二典范軸（RDA2）的解釋率分別為52.60%和2.64%（圖2）。對各典范軸進行置換檢驗，其整體F/sig為6.604/0.001，達到極顯著水平。具體到單個典范軸，只有第一典范軸（RDA1）達到了顯著水平（F/sig為31.045/0.001）。

Glomus，Scutellospora和Acaulospora的矢量長度比Ambispora和Paraglomus長，表明前三者對RDA1和RDA2的貢獻率均較大。Glomus與Scutellospora和Acaulospora均為負相關，與Paraglomus正相關;Scutellospora與Acaulospora，Ambispora正相關。土壤速效養分的向量均位于第三象限，之間的夾角均為銳角，表明兩兩之間均為正相關，硝態氮與速效鉀最明顯，二者幾乎在一條直線上。另經檢驗，速效鉀（AK）與銨態氮（NH4）的Pearson相關系數高達0.739，達到極顯著水平。Glomus與速效磷、速效氮、銨態氮正相關，與銨態氮和速效鉀相關性不明顯。Acaulospora與速效磷，速效氮的夾角為鈍角，表現為較弱的負相關。而Scutellospora則與所有速效養分都表現出了較強烈負相關。Paraglomus與所有速效養分均表現出了正相關，而Ambispora與大部分速效養分均表現出了負相關。

粘土4個處理共16個樣點，有11個分布在第三象限，5個分布在第二象限，對RDA1的貢獻均為負值;砂質壤土則有3個樣點對RDA1的貢獻為正，其它13個點均在第一和第四象限。三序圖上兩種土壤的樣點的分布也說明二者之間的AMF群落結構差異。

3 討論與結論

AMF是土壤微生物區系中分布最為廣泛的一類菌根真菌，能與地球上90%的維管植物形成叢枝菌根，從而促進作物對養分的吸收，適應逆境脅迫。本研究中AMF主要為球囊霉屬（Glomus）、無梗囊霉屬（Acaulospora）、盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）、類球囊霉屬（Paraglomus）和雙型囊霉屬（Ambispora）。雙型囊霉屬僅在砂質壤土中檢測到一個種。蘇鳳秀等[13]調查發現，廣西木薯主產區土壤有19種AMF孢子，球囊霉屬（Glomus）和無梗囊霉屬（Acaulospora）為優勢類群，本研究可確定的AMF屬有5個，優勢屬同樣為球囊霉屬和無梗囊霉屬，各處理物種數分別為14～17個，與其研究結果相似。

本研究中，兩種土質各處理AMF在屬和種水平的相對豐度最高的均為球囊霉屬，而雙型囊霉屬僅在砂質壤土中分布，且相對豐度較低，僅為0.02%～0.19%。球囊霉屬分布廣泛，適應性強，是AMF中的優勢菌屬，比其他類群更容易適應環境變化[20]，與植物根際氮磷利用率顯著相關的關鍵微生物類群[21]。球囊霉屬真菌除了具備促進作物氮磷利用的功能外，還可以通過分泌球囊霉素提高土壤有機質含量，改善土壤排水通氣狀況，進而提高作物對氮磷養分的利用[22]。本研究兩種不同的土質中均檢測到獨有種。其中，粘土根袋外（Claysoil）檢測到球囊霉屬的4個獨有種，分別為Glomus sp.Alguacil09b、Glomus sp.VTX00222、Glomus sp.VTX00319、Glomus sp.VTX00419;Glomus sp.VTX00227、Glomus sp.Kluber12、Glomus sp.VTX00310、Paraglomus sp.VTX00308為根袋內特有種。說明這些種對粘土具有高度專一性，生存環境的改變都會導致其消失或者休眠到無法檢測。而根袋內發現特有種，說明其對根域土壤具有專一性，可能受木薯根系分泌物等因素影響。砂質壤土獨有種包括Glomus sp.Glo-E VTX00319、Glomus sp.VTX00085、Acaulospora sp.VTX00242、Acaulospora sp.VTX00026、Paraglomus sp.VTX00375。根袋外有兩個特有種：Glomus sp.Glo-E VTX00319、Glomus sp.VTX00085;而Glomus sp.VTX00099在根袋內土壤為100 g時大量繁殖，其有效tags達到18489個，說明其分布受根距影響較大。且作者在前期的研究中發現[17]，根袋中100 g土可視為根際土壤，表明該種是砂質壤土條件下木薯根際特有種，受根際影響大。

不同土壤類型、質地、土壤肥力因子都會顯著影響AMF的種屬分布、孢子密度和AM的侵染狀況[23-24]。本研究中兩種土質各處理AMF在屬水平上無顯著差異，但種水平分布受土壤質地及根袋內土重的影響，粘土的AMF多樣性（Simpson指數）高于砂質壤土。木薯是典型的AMF依賴型植物，AMF群落保持穩定性可能是由于其更多與植物進行交互作用，試驗處理對其多樣性影響較小。兩種土壤質地里都發現獨有種，說明土壤質地對AMF群落分布有一定的影響。RDA分析表明Glomus與速效磷、速效氮、銨態氮正相關。前人研究發現，Glomus與氮磷養分利用率顯著相關[21];Acaulospora與速效磷，速效氮弱負相關;而Scutellospora則與所有速效養分都表現出了較強烈負相關;Paraglomus與所有速效養分均表現出了正相關;Ambispora與大部分速效養分均表現出了負相關。

綜上所述，木薯根域AMF資源豐富，不同土壤質地條件下AMF群落組成和豐度存在差異，土壤速效養分與AMF群落結構差異密切相關。深入研究土壤因子與AMF多樣性和豐度的關系，可為進一步探索AMF在木薯上的應用提供良好的基礎，相關內容需進一步研究。

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