應用高通量測序方法研究CRF01-AE亞型HIV-1毒株耐藥突變的分子進化規律

鄧永岳,吳守麗,邱麗君,嚴延生

(1.福建醫科大學 公共衛生學院,福建 福州,350001;2.廈門大學附屬中山醫院 感染科,福建 廈門,361000;3.福建省疾病預防控制中心 福建省人獸共患病研究重點實驗室,福建 福州,350001;4.福建省立醫院 醫院感染管理部,福建 福州,350001)

大量研究[1-3]表明，隨著艾滋病抗反轉錄病毒治療(ART)的推廣，耐藥的流行趨勢也越來越嚴重。一項針對來自64 個低中收入國家的56 044例感染人類免疫缺陷病毒(HIV)的成年人的薈萃分析[4]估計，在所有地區中每年的治療前耐藥率的年增長率均大幅增加。鑒于耐藥現狀，世界衛生組織(WHO)強烈推薦更有效地利用有限的資金對治療患者進行耐藥監測并努力確保提供適當的一線藥物[5],這就要求對當地流行毒株耐藥突變的分子進化規律有足夠的了解，才能合理選擇耐藥監測的時間點。近年來，國外學者應用高通量測序方法研究HIV耐藥突變取得了很好的效果，但國內未見報道。本研究參考DUDLEY D M等[6]建立的檢測方法，重新設計適合的測序引物，研究本地區流行毒株在接受抗病毒治療過程中耐藥突變發生和發展的規律，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇5例在福建省疾控中心經6～8年一線抗病毒治療并發生耐藥的人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)CRF01-AE亞型艾滋病患者作為研究對象，每例患者每年至少隨訪1次，總隨訪次數≥6次，隨訪時收集患者的EDTA抗凝全血,-80 ℃低溫冰箱保存，統一檢測。共收集41份血清標本用于分析，病毒載量>1 000 copies/mL的標本可用于耐藥檢測。

1.2 方法

1.2.1 擴增子文庫準備:① 提取RNA,取140 μL血漿，采用Qiagen試劑盒提取RNA,操作嚴格按照說明書進行。② 巢式PCR第1輪，采用一步法RT-PCR,PCR反應條件為50 ℃ 60 min,94 ℃ 2 min,94 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s(循環2次),94 ℃ 15 s,58 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s(循環2次),94 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s(循環16次),68 ℃ 10 min。引物信息見表1。③ 巢式PCR第2輪，分3個片段擴增pol基因2 199～3 285區域，標記為Pro、RT-A、RT-B,PCR反應條件為94 ℃ 2 min,94 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s(循環2次),94 ℃ 15 s,58 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s(循環2次),94 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s(循環16次),68 ℃ 10 min。模板特異性引物序列信息見表2。

表1 一步法RT-PCR引物信息

表2 模板特異性引物序列信息

1.2.2 高通量測序:擴增子文庫經過純化、質控和定量以及稀釋和富集后進行EmPCR和Roche 454高通量測序。

1.2.3 序列分析:使用Mothur軟件(Version 1.31.2,http://www.mothur.org/)對原始測序數據進行過濾，根據質量分數修剪3′端，去除Roche/454 amplicon adaptors和短于50 bp的序列。將序列與HXB2參考株(GenBank NC_001802)進行比對，然后采用GATK軟件進行SNP calling,使用參數為“stand_call_conf 50 -stand_emit_conf 10”。最后根據Stanford HIV drug resistance data base (Stanford HIVDB)已知耐藥突變，列出相應位點的特定氨基酸改變，將SNP calling的結果與之比對，計算含有某個位點耐藥突變的序列在覆蓋到該位點的總序列中的比率，<20%的耐藥突變定義為劣勢耐藥突變。

2 結 果

2.1 標本的基本信息

共選取5例患者在抗病毒治療前后的系列標本進行高通量測序分析，隨訪7～9次，時間跨度6～8年，標本的基本信息見表3。

表3 標本的基本信息

2.2 耐藥突變特征

第1例患者治療5個月后，即檢測到接近100%高頻的核苷類逆轉錄酶抑制劑(NRTIs)M184V突變，此后一直持續存在，即使更換治療方案并停用3TC長達29個月，也始終能被檢測到，見表4。治療3個月后，即檢測到高頻胸腺嘧啶脫氧核苷類似物變異(TAMs)D67N和K70R,其中D67N在整個治療過程中持續存在，但K70R在下一次隨訪中就不再出現。一線方案治療40個月后出現 Q151M/A62V/V75I,換二線方案治療后又出現F77L和F116Y,形成完整的151復合體。非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs)類耐藥突變比較簡單，在用藥后第1次隨訪即檢測到高頻主要耐藥突變G190A,比率接近100.00%,停用奈韋拉平(NVP)后未用其他NNRTIs藥，但4年后仍存在該類藥物的高頻突變。患者在啟動治療后第3次隨訪時換用含蛋白酶抑制劑(PIs)類藥物茚地那韋(IDV)的方案，在第4次隨訪時就檢測到PI類耐藥，即高頻的M46I(99.96%)和中高頻的I84V(61.66%),第5次隨訪時其頻率都接近100.00%,同時還新出現了L76V(100.00%),這3種耐藥突變在隨后的幾次檢測中一直存在，即使換含克力芝的二線方案也一樣。

表4 第1例患者的主要耐藥突變頻率情況[n(%)]

第2例患者治療3個月后，即出現高頻M184V突變，且一直維持在整個治療過程中，見表5。在治療過程中也形成TAMs突變，與第1例患者不同的是，第2例患者主要通過TAM1途徑?；颊咴谟盟幒蟮?次隨訪即檢測到NNRTIs類高頻主要耐藥突變K101E和G190A,停用相應藥物或換二線藥物后，突變也始終存在;患者換用含PIs類藥物IDV的方案5個月后，檢測到低頻V82A(2.73%);在換含克力芝的二線方案2個月后，檢測到都接近100.00%的M46I和V82A;第6次隨訪時，在此基礎累加了高頻的I47V(100.00%)、F53L (98.44%)和I54V(99.72%);第7次隨訪時繼續增加了L76V(80.11%);總體上而言，使用PIs類藥后,PIs類藥物突變不斷累加，至末次隨訪時共檢測到5個接近100.00%高頻的主要突變。

表5 第2例患者的主要耐藥突變頻率情況[n(%)]

第3例患者治療7個月后出現M184V突變且一直維持在整個治療過程中，見表6。與第1例和第2例患者不同的是，該患者的一線和二線方案都含拉米夫定(3TC),治療過程中主要通過TAM2途徑形成多重耐藥TAMs,治療早期即出現高頻D67N、K70R,治療中T215F和K219Q頻率逐漸增加。治療中還形成不完整的第2種多重耐藥:69插入復合物，可以看到T69N/D從低頻到高頻的演變過程。NNRTIs類耐藥突變方面，患者在用藥后第1次隨訪即檢測到K103N和G190A,停用相應藥物或換二線藥物，突變也始終存在。該患者在治療后第6次隨訪前使用PIs類藥物(含克力芝的二線方案)，隨后就檢測到高頻的M46I(100.00%)、I47V/A(98.88%)、I84V(100.00%)和低頻V82A(1.16%);第7次隨訪時,3種高頻突變維持不變,V82A未檢測到，但檢測到低頻G73S(1.03%)。

表6 第3例患者的主要耐藥突變頻率情況[n(%)]

第4例患者治療7個月后出現M184V突變并一直維持在整個治療過程中，換二線方案前未出現明顯的多重耐藥,TAM類突變僅有K219Q,而M41L和K70R一度出現低頻，但隨后消失。NNRTIs類耐藥突變方面，患者在用藥后第1次隨訪即檢測到高頻主要耐藥突變G190A,還出現一過性低頻K103N和V108I。該患者在第6次隨訪前才使用PIs類藥物(含克力芝的二線方案)，更換方案后治療有效，病毒轉陰。在整個治療過程中，未監測到高頻PIs類突變，僅在第2次隨訪時檢測到一過性的低頻PIs類K20R(14.15%),第4次隨訪時檢測到一過性的低頻PIs類I84V(1.69%)。

第5例患者治療2個月后出現M184V突變并一直維持在整個治療過程中，治療中通過TAM2途徑形成TAMs突變，但出現時間較第3例患者更晚，在第3次隨訪后逐漸形成，換二線方案前未出現明顯的多重耐藥?；颊咴谟盟幒蟮?次隨訪即檢測到高頻主要耐藥突變G190A,治療中后期出現高頻K103N。在第6次隨訪前才使用PIs類藥物(含克力芝的二線方案)，更換方案后治療有效，病毒轉陰。整個治療過程中未監測到高頻PIs類突變。

3 討 論

HIV-1在宿主體內不斷變異，形成了一個由高度同源而又各不相同的變異體組成的病毒群，即所謂的準種。由于耐藥突變的適應性代價，耐藥準種在治療前一般以低比率劣勢準種的形式存在，在藥物選擇壓力下，劣勢耐藥準種具有生長優勢，會被篩選出來，逐漸變成體內優勢病毒株，這被認為是治療失敗的主要原因。掌握劣勢耐藥準種分子進化規律對制訂耐藥監測方案有重要意義，但由于受到檢測劣勢突變的方法學限制，在這方面的研究較少。既往研究[7-9]大多采用的是克隆RT-PCR產物測序法、單基因組擴增法、等位基因特異性PCR法等，但都不能很好地體現比率<20%的“劣勢準種”，因此無法掌握耐藥突變早期的發生發展規律。本研究成功運用高通量測序方法，檢測出比率<1%的HIV“劣勢準種”，觀察到耐藥準種從極低占比開始逐漸發展為高占比優勢毒株的過程，這將為臨床制訂恰當的耐藥監測方案提供科學依據。

3.1 NRTIs類耐藥突變的進化規律

NRTIs是首類被美國食品藥品監督局(FDA)批準的藥物，也是目前應用得最多的一類藥物。本研究的一線和二線方案中均包含3TC,本研究的5例患者均在治療后第1次隨訪時就出現M184V,第5例患者更是在啟動治療2個月后即檢測到了這一突變，提示耐藥監測的時間應適當提前。本研究還發現的顯著特征是M184V的頑固性，作者觀察到M184V一旦出現后，就會一直維持在整個治療過程中，即使停用3TC也不會消失，例如第1例患者停藥達29個月，第2例患者停藥達21個月，但仍然能繼續檢測到M184V突變。一線方案中的另一種NRTI藥物是胸苷類似物齊多夫定(AZT)或司他夫定(D4T),其選擇出來的耐藥突變主要是TAMs,TAMs促進焦磷酸水解，并參與AZT和的D4T的切除[10-11]。TAMs的形成是不斷積累的過程，其在HIV-1逆轉錄酶的氨基酸變化包括2個不同的的途徑:TAM1途徑(M41L、L210W、T215Y,偶見D67N)和TAM2途徑(D67N、K70R、T215F、K219E/Q)[12]。作者觀察到第1、3、4、5例患者是TAM2路徑，第2例患者是TAM1途徑。借助于低頻突變的檢測，本研究從第2例患者身上發現2種不同途徑的進化模式，即在用藥初期時所有6種突變TAMs都會產生，但存在競爭關系，其中一種途徑的突變會占上風，頻率逐漸增加，而另一種途徑的突變會被淘汰。但是2種不同途徑的突變并不是絕對不相容的，隨著治療時間的延長，不同途徑的突變也會發生組合，例如第3例患者前期只有途徑2的突變，第6次隨訪后累加途徑1的突變(M41L),其原因可能是這位患者當時已經持續使用了5年的D4T。

3.2 NNRTIs類耐藥突變進化規律

與其他類耐藥顯著減少復制適應性不同的是,NNRTIs的單核苷酸的變化就可能導致高水平耐藥性，同時只有輕微的復制適應性損失[13]。本研究觀察到5例患者中只有第3例患者在用藥后期累積了4種突變，其他4例患者都只有1～2種突變。既往報道中，一般主要的NNRTIs突變包括:K103N、V106A/M、A98G、Y181C/I,但本研究觀察到的是G190A幾乎“一枝獨秀”，其特點和此前討論的M184V類似，出現的時間極早、持續時間極長、停藥后不消失，似乎在CRF01-AE亞型中,G190A的競爭優勢非常明顯。因為，通過高通量測序可以發現治療過程中其他突變通常只會低頻出現，大多數隨即消失，只有少數逐漸累積到耐藥中,G190A的這種適應性優勢現象在之前的報道中未被提及。有學者[14-15]分析中國治療失敗的HIV感染者耐藥變異結果,NRTI類最多的是M184V(42.7%),NNRTI類最多的是G190A(23.4%),與本研究結果一致,5例患者都存在M184V+G190A的基本組合，說明這種組合有治療失敗的預警價值。關鍵的是，作者發現這2種突變都是非常迅速地出現，都在治療后第1次隨訪就可以檢測到，說明了及早進行耐藥監測的重要性。

5例患者更換相同的二線方案后,3例無效,2例病毒轉陰，換藥有效。與患者開始二線方案前的耐藥情況比較發現不同之處在于換藥前是否存在針對NRTIs類的多重耐藥突變，第1例患者有Q151M多重耐藥復合體，第2例患者有TAM1途徑耐藥組合，第3例患者有T69插入多重耐藥復合體，其都出現換藥失敗，而第4、5例患者未發現這些多重耐藥突變，二線治療獲得成功。因此，耐藥監測對用藥及一線方案失敗后更換二線治療方案具有重要的指導意義。

綜上所述，本研究應用高通量測序方法初步闡明了CRF01-AE亞型患者在接受抗病毒治療過程中pol基因區耐藥突變的分子進化規律，這對準確監測耐藥發生并確保提供適當的一線藥物方案有重要意義。同時，本研究也發現，隨訪間隔時間過長，特別是治療初期沒有盡早開展耐藥檢測，對完全掌握耐藥突變的進化規律會造成一定的影響，今后的研究中還需改進。