AMPK活化調控的能量代謝對宰后牦牛肉肉色穩定性影響的研究

陳煉紅，王琳琳，高代微

（西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都 610041）

肉色是影響鮮肉適銷性的重要因素之一，而鮮亮的櫻桃紅色通常是消費者作為評價鮮肉新鮮和健康的標準。近年來，諸多學者對影響肉色及肉色穩定性的因素進行了廣泛的研究，其中部分學者研究了線粒體在肉色及肉色穩定性中的作用。如Arihara等[1]研究發現高鐵肌紅蛋白還原酶（Metmyoglobin reductase activity，MetMbR）活性作為影響鮮肉在貯藏期間肉色穩定性的一個重要的因子，其主要存在于線粒體上，微粒體上很少；Joseph等[2]研究發現添加丙酮酸、乳酸鹽、琥珀酸鹽和蘋果酸等三羧酸循環中間的代謝產物于宰后肌肉中，能夠刺激肌肉再生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）的過程，進而提高高鐵肌紅蛋白（Metmyoglobin，MMb）的還原能力，維持肉色的穩定。

不同部位牦牛肉在宰后成熟過程中肉色穩定性具有的差異性。同時，本課題組在前期研究中已明確和其他部位相比，牦牛背最長肌肉色具有較好的穩定性。因此，本研究以牦牛背最長肌為研究對象，分別以AICAR和Compound C為激活劑和抑制劑，測定宰后成熟過程中肉色及能量代謝的相關指標的變化趨勢，確定能量代謝指標與肉色指標之間的相關性，以期明確AMPK活化調控的能量代謝對宰后牦牛肉肉色穩定性的影響以及為闡明宰后牦牛肉肉色穩定性機理的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛背最長肌 選取產自四川省紅原縣同一牧場，平均年齡3.5歲、生長發育良好、體重相近的牦牛4頭，以宰后將牦牛背最長肌置于液氮中保存；AICAR、Compound C、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸、三氯乙酸、濃硫酸、硫脲、蒽酮、葡萄糖、蔗糖、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、硫酸銅、牛血清蛋白等 均為分析純，成都康迪生物技術有限公司；牛MR ELISA試劑盒、牛磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）ELISA試劑盒、牛NADH ELISA試劑盒、牛GS試劑盒 上海酶聯生物科技有限公司；乳酸試劑盒、肌酸激酶試劑盒、己糖激酶試劑盒、LDH試劑盒 南京建成生物工程研究所。

FSH-2A可調高速組織勻漿機 金壇市華城海龍實驗儀器廠；Thermo Scientific Revco ULT-1786-6V超低溫冰箱 美國賽默飛科技公司；MP511 Lab pH計 上海三信儀表廠；UV2100紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；Centrifuge 5804 R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Rayto RT-6100酶標儀 濟南駿馳生物科技有限公司；pH STAR胴體肌肉pH值直測儀 德國Ingenieurhuro R.Matthaus公司；CR-400便攜式色差儀 日本Konica Minolta 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本處理 將液氮中保存的肉樣恢復至0 ℃左右，迅速剔除表面的脂肪和結締組織，并將其迅速切成5×5×4 cm的肉塊，隨機分成三組，按照肉液比10：1（w/v）將溶液均勻的注射進肉樣。第一組注射50 mmol/L AICAR溶液，第二組注射50 mmol/L Compound C溶液，第三組作為空白對照樣品，并將樣品放置于4 ℃條件下成熟，時間點分別設置為6、12、24、72、120、168 h，在相應時間點測定pH、肉色、MetMbR、AMPK活性、NADH含量、糖原合成酶（GS）活性和乳酸脫氫酶（LDH）活性等指標的測定[4]。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 AMPK活性測定 AMPK活性的測定參照董笑含[9]的方法。AMPK通過AMPKα亞基上的Thr172位點磷酸化被激活，因此本實驗通過測定磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）的水平來確定AMPK的活性，具體操作和結果計算參照牛p-AMPK酶聯免疫檢測試劑盒的說明進行。

1.2.2.2 肉色測定 在相應的成熟時間點取樣，采用已經進行白板校正的色差儀測定肉色，每個肉樣取5個不同的點測定其L*值、a*值和b*值，取其平均值。并計算H*，公式為：

在國外，融資租賃之所以發展快速，一方面是因為起步較早，另一方面是因為政府對該行業的扶持。而我國，政府近幾年才對該行業重視，但人才的培養、市場環境的完善都需要時間，該行業缺乏一個整體、系統的政策支持。尤其是西部地區，西部市場經濟沒有東部發達，對外資的吸引力不強，這方面更加需要政府的幫助。目前，西部融資租賃業面臨兩大發展機遇：其一，正值“西部大開發”計劃的第二階段，是加快西部經濟產業化以及市場化步伐的關鍵時期。其二，習總書記2013年提出的“一帶一路”囊括了我國西部絕大部分地區，這對西部的發展又是一個強有力的推動。西部各級政府應借此機遇，助力融資租賃業的發展，進而促進經濟的增長[6]。

1.2.2.3 pH測定 使用胴體pH計測定。取各樣品3個不同位置點進行測定，計算并取其平均值。

1.2.2.4 總色素含量測定 參照Krzywicki等[10]的方法，略做修改。取肉樣10 g，加入0.04 mol/L、pH6.8的磷酸鹽緩沖液20 mL，勻漿25 s。勻漿液在4 ℃條件下靜置1 h后，在3300 r/min條件下離心30 min。用濾紙過濾所取上清液并用上述緩沖液定容至25 mL，測定波長分別為525、545、565、572 nm處樣品的吸光度。

式中：R1、R2、R3分別是吸光率比值A572/A525、A565/A525、A545/A525。

1.2.2.5 糖原含量測定 糖原標準曲線繪制：采用蒽酮比色法測定糖原含量并繪制標準曲線。選取6支20 mL試管作為標準管，編號后分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的葡萄糖標準液（1 mg/mL），再依次加入蒸餾水3、2.5、2、1.5、1、0.5 mL，再分別沿試管壁緩緩加入4 mL蒽酮試劑（0.2 g蒽酮和2.0 g硫脲溶解于100 mL濃硫酸），混合后震蕩1 min，立即置冰水中冷卻。將冷卻好的試管放入沸水浴中煮沸15 min，取出試管立即放入冷水中充分冷卻，將冷卻好的液體倒入玻璃比色皿中，于620 nm波長下測定吸光度。制得的糖原標曲為y=2.2989x-0.0029，R2=0.9996。其中y為吸光值，x為糖原濃度（mg/mL）。

糖原含量測定：參照王琳琳[11]的方法并加以修改測定。準確稱取肉樣1 g，加入5%的三氯乙酸8 mL，研磨至固體消失。將研磨液在8000 r/min，4 ℃下離心20 min，將上清液轉移定容至25 mL容量瓶中，震蕩混勻；取2.5 mL上述溶液，加入4 mL蒽酮試劑，混合后震蕩1 min，立即置冰水中冷卻，冷卻后再沸水浴15 min，充分冷卻后，于620 nm波長下測定吸光度，之后操作步驟同上。用以下公式計算糖原含量：

式中：Y：糖原含量，mg/g；M：通過對照標準曲線查得1 mL提取液中的葡萄糖當量，mg/mL；0.9：將葡萄糖換算為糖原的系數；25：定容體積，mL。

1.2.2.6 NADH含量、MetMbR和GS活性測定NADH含量、高鐵肌紅蛋白還原酶活性和糖原合成酶活性測定均采用上海酶聯生物科技有限公司的試劑盒進行，具體操作和結果計算參照各試劑盒的說明進行。

1.2.2.7 乳酸含量、LDH活性、己糖激酶活性和肌酸激酶活性測定 乳酸含量、乳酸脫氫酶活性、己糖激酶活性和肌酸激酶活性的測定均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行，具體操作和結果計算參照各試劑盒的說明進行。

1.3 數據處理

所有數據均為三次重復測定的平均值，結果用平均值±標準差表示。利用SPSS20.0對數據進行統計分析獲得平均值和標準差，采用Duncan多重比較進行顯著性方差分析，顯著性水平P＜0.05。作圖采用Microsoft 2016 Excel軟件。

2 結果與分析

2.1 宰后成熟期間AMPK活性的變化

由圖1可知：在宰后肌肉成熟過程中，三組AMPK的活力均呈先上升后下降的趨勢，這個結果與高永芳等[12]研究結果相似。在成熟初期（6～12 h）AMPK活力顯著上升（P＜0.05），這是由于動物宰后氧氣中斷，肌肉進行糖酵解產生能量，ATP含量減少，而肌肉中ATP的消耗仍在繼續，使得AMP：ATP的比值增加，從而激活AMPK[4]。成熟12 h后AMPK活力顯著下降（P＜0.05），這可能是由于胴體糖原含量有限，隨著成熟時間的延長糖原逐漸被消耗完，糖酵解逐漸停止，AMPK活性不再升高，因此宰后AMPK被激活后不久，活性即開始下降[5]。

圖1 成熟期間牦牛肉AMPK活力的變化Fig.1 Changes of AMPK activity of yak beef during postmortem aging

此外，在同一成熟時間點，AICAR組的AMPK活力顯著高于其余兩組（P＜0.05），而對照組的AMPK活力顯著高于抑制組（P＜0.05）。說明AICAR對AMPK的活性起到了激活作用，成熟至12 h，AICAR組、對照組和Compound C組的AMPK活力均達到峰值，分別為76.07、67.22、61.15 U/L，與對照組相比，AICAR組AMPK活力提高了13.17%，而抑制組降低了9.03%。成熟至168 h，三者AMPK活力分別為42.01、39.95、37.03 U/L，與對照組相比，AICAR組AMPK活力提高了5.16%，而Compound C組降低了7.31%。表明隨著成熟時間的延長，AICAR激活AMPK的能力逐漸下降，Compound C抑制AMPK的能力也逐漸下降[12]。該結果與高永芳等[12]研究結果一致。

2.2 AMPK活力對宰后成熟期間牦牛肉肉色的影響

由表1可知：在成熟過程中，AICAR組、Compound C組和對照組的L*值和a*值均呈先上升后下降趨勢，且L*值在120 h達到峰值，a*值在12 h達到最大值，與高永芳等[12]指出的AICAR處理的牛肉和對照組在宰后成熟期間L*值和a*值的變化趨勢基本一致。此外，在同一成熟時間點，三者L*值的大小依次為AICAR組＞對照組＞Compound C組，其中除12 h外，在其余時間點AICAR組的L*均顯著高于Compound C組（P＜0.05）；而在同一成熟時間點，a*值的大小依次為AICAR組＜對照組＜Compound C組，其中除12、120、168 h以外，其余時間點Compound C組與對照組的a*值均顯著高于AICAR組（P＜0.05）。成熟后期L*值上升是由于pH到達等電點，肌球蛋白和肌動蛋白等蛋白質發生收縮和凝固而成為顆粒狀，使得游離水增加導致肉的系水力下降，滲出至肉表面的水分增多，肉色發亮[13]；a*值下降是因為肌肉中OMb與氧氣接觸，生成MMb（暗褐色），OMb（鮮紅色）含量的降低以及MMb含量的增加導致a*值的下降[8,12]。由以上分析可知，在整個成熟階段AICAR組的亮度更大，而Compound C組的肉色更紅。

表1 成熟期間牦牛肉肉色的變化Table 1 Changes in meat color of yak beef during postmortem aging

隨著成熟時間的延長，AICAR組、Compound C組和對照組的b*值和H*值均呈逐漸上升的趨勢，其中b*值和H*值始終為AICAR組＞對照組＞Compound C組。并且除6、24 h以外，Compound C組的b*值均顯著低于其余時間點AICAR組的b*值（P＜0.05）；而在整個成熟階段，Compound C組的H*值均顯著低于AICAR組（P＜0.05）。由于H*值越低表示肉色越鮮紅，由此可知Compound C組的肉色較其余兩組鮮紅。

2.3 AMPK活力對宰后成熟期間牦牛肉pH的影響

由圖2可知，隨著成熟時間的延長，處理組與對照組的pH均呈先下降后緩慢上升的趨勢，在成熟6～72 h時間段內pH顯著下降（P＜0.05）。這是由于動物宰后生化反應還在繼續，肌糖原酵解產生乳酸和蛋白質降解使得pH不斷下降[14]。同時，磷酸肌酸系統的代謝產物肌酸以及ATP分解產生的磷酸也會使pH下降[15]。隨著成熟時間的延長，Ca2+從肌質網中釋放出來并且激活鈣激活酶，作用于肌間蛋白質使其分解一些堿性物質造成成熟后期肌肉的pH升高[16]。在整個成熟過程中，三者的pH大小始終為AICAR組＜對照組＜Compound C組。并且在成熟至120 h時，AICAR組、Compound C組以及對照組的pH分別下降至最低值5.53、5.61和5.67。與對照組相比，AICAR組pH降低了0.08，Compound C組pH上升了0.06，說明AICAR組的pH下降速度較對照組快，Compound C組則與之相反。由此可知，AICAR加快了糖酵解進程，縮短了宰后牦牛肉成熟時間，Compound C則與之相反。這與袁倩等[17]報道的AMPK活性與不同極限pH牛肉的產生密切相關的結論相一致。

圖2 成熟期間牦牛肉pH的變化Fig.2 Changes of pH of yak beef during postmortem aging

2.4 AMPK活力對宰后成熟期間牦牛肉色素含量的影響（TMb、OMb、MMb）

牦牛背最長肌在宰后成熟期間AICAR組、Compound C組和對照組的TMb含量變化結果如圖3所示。在成熟期間三組TMb含量均成下降趨勢，且6 h顯著高于168 h（P＜0.05）。這是由于隨著排酸時間的延長，肌紅蛋白周圍失水，使其與氧氣充分接觸，氧化生成MMb[18]。與自身的L*值隨著時間的延長呈先上升的后下降的趨勢一致。AICAR組、Compound C組以及對照組成熟至168 h時，其TMb含量與6 h相比，分別下降了34.52%、31.63%和33.67%。說明Compound C組TMb含量下降的速度較對照組和AICAR組慢，Compound C組在成熟過程中牦牛肉色穩定性更佳。在同一成熟時間點，除72 h以外，三者之間差異均不顯著（P＞0.05）。但從趨勢上可以看出，三者TMb含量高低依次為Compound C組＞對照組＞AICAR組。由于肌肉中肌紅蛋白的含量與分布影響牦牛的色澤，因此可以推測在成熟過程中Compound C組的肉色較對照組和AICAR組更鮮紅。

圖3 成熟期間牦牛肉TMb含量的變化Fig.3 Changes of TMb content of yak meat during postmortem aging

圖4 和圖5描述了AICAR組、Compound C組和對照組在成熟期間肌紅蛋白主要的兩種氧化狀態（OMb和MMb）相對含量的變化趨勢。在成熟初期（6 h）牦牛肉中肌紅蛋白主要以OMb的形式存在，AICAR組、Compound C組和對照組的OMb分別為55.67%、60.17%和59.13%，MMb含量分別為9.84%、10.06%和12.35%，三者之間均無顯著性差異（P＞0.05）。隨著成熟時間的延長，三組OMb含量均呈顯著下降趨勢（P＜0.05），而MMb含量呈顯著上升趨勢（P＜0.05），OMb與MMb含量為“此消彼長”模式。該結果與陳騁[19]等研究結果相一致。這是由于該實驗在未隔絕氧氣的條件下成熟，因此DeoMb會快速與氧氣結合，形成OMb或直接氧化為MMb，而MMb不能及時還原為OMb，造成MMb的積累，從而使得肉色逐漸向MMb的暗褐色發展[19]。與成熟6 h相比，AICAR組、Compound C組和對照組的OMb含量在第168 h時分別降低了41.38%、40.40%和40.57%，而MMb含量則分別上升了310%、291%和309%。在整個成熟過程中，Compound C組的OMb含量始終高于其余兩組，且在24、72 h時差異顯著（P＜0.05）；而Compound C組的MMb含量始終低于其余兩組，12、24、72、168 h時差異顯著（P＜0.05）。說明在整個成熟過程中Compound C組肌紅蛋白的氧化速率低于對照組和AICAR組，故Compound C組的肉色較對照組和AICAR組更鮮紅，與2.2結果相一致。

圖4 成熟期間牦牛肉OMb含量的變化Fig.4 Changes of OMb content of yak meat during postmortem aging

圖5 成熟期間牦牛肉MMb含量的變化Fig.5 Changes of MMb content of yak meat during postmortem aging

2.5 AMPK活力對宰后成熟期間MetMbR活性的影響

圖6 描述了牦牛背最長肌在成熟期間AMPK活力的變化對其MetMbR活性的影響。如圖所示，AICAR組、Compound C組和對照組的MetMbR活性隨著成熟時間的延長均呈下降趨勢。成熟6 h時MetMbR活性顯著高于168 h時（P＜0.05），表明此時肌肉中MetMbR能夠及時的將氧化的肌紅蛋白還原，進而降低了MMb的積累速率。隨著成熟時間的延長，成熟168 h時，AICAR組、Compound C組和對照組的MetMbR活性僅為6 h的39.74%、42.72%和41.41%。MetMbR活性在成熟期間的變化規律解釋了圖5中相應時期MMb含量迅速升高的原因。而在同一成熟時間內，三者MetMbR活性大小依次為Compound C組＞對照組＞AICAR組。說明在整個成熟過程中，Compound C組高鐵肌紅蛋白還原能力優于其余兩組。Mckenna等[20]對牛肉宰后胴體的色澤穩定性的研究中指出，健康畜禽在屠宰后，其胴體中的MetMbR活性越高，相應的肉色穩定性就越高。由此可知，三者肉色穩定性依次為Compound C組＞對照組＞AICAR組，即AMPK活力的抑制有利于牦牛背最長肌在成熟期間肉色的穩定。

圖6 成熟期間牦牛肉MetMbR活性的變化Fig.6 Changes of MetMbR activity of yak beef during postmortem aging

2.6 AMPK活力對宰后牦牛肉糖原的影響

由圖7可知，AICAR組、Compound C組和對照組的糖原含量隨著成熟時間的延長呈顯著下降的趨勢（P＜0.05）。糖原是機體能量的主要來源，在動物屠宰以后，糖原進行無氧酵解提供各種生化過程所需的能量，糖原含量會逐漸減少，生成乳酸使得pH下降，直至抑制糖酵解酶的活性為止[21]。在成熟過程中，除6 h以外的其余時間點，Compound C組的糖原含量顯著高于對照組和AICAR組（P＜0.05）。說明AMPK的激活確實加速了糖原的分解，這與Kurth-Kraczek等[22]證實AMPK的激活可加速糖原分解，同時促進骨骼肌糖酵解的結論基本一致。這是由于AMPK可以通過作用于GS和糖原磷酸化酶以及GLUT4的移位，促進骨骼肌對葡萄糖的吸收，抑制肝糖原的異生以及促進骨骼肌糖酵解，從而影響肌肉中糖原的含量[23]。

圖7 成熟期間牦牛肉糖原含量的變化Fig.7 Changes of glycogen concent of yak beef during postmortem aging

2.7 AMPK活力對宰后牦牛肉乳酸的影響

由圖8可知，隨著成熟時間的延長，AICAR組、Compound C組和對照組中乳酸的含量均呈上升趨勢。在成熟初期（6～12 h），三組乳酸含量呈顯著上升趨勢（P＜0.05）；而在成熟后期（72～168 h），三組的乳酸含量非顯著性增加（P＞0.05）。這是由于動物宰后，糖酵解產生乳酸，而乳酸不能通過血液循環排除或在肝中合成肝糖原，因此大量的蓄積在肌肉中，使其含量逐漸升高[9]。在整個成熟過程中，Compound C組的乳酸含量始終低于對照組和AICAR組。在成熟6～72 h內，處理組和對照組之間乳酸含量差異不顯著（P＞0.05）；而在成熟后期（120～168 h），AICAR組的乳酸含量顯著高于Compound C組（P＜0.05）。這是由于AMPK的激活會加快宰后肌肉的糖酵解速率，從而導致AICAR組的乳酸含量高于其余兩組[4]。乳酸的不斷累積是導致宰后肌肉pH下降的主要原因，而宰后胴體pH不正常的降低會容易出現白肌肉（PSE）肉和黑干肉（DFD），兩種肉外觀顏色均相對差，嚴重影響銷售[5]。由此可以推斷，控制宰后肌肉乳酸的積累速率，有利于保護肉色。

圖8 成熟期間牦牛肉乳酸含量的變化Fig.8 Changes of lactic acid content of yak beef during postmortem aging

2.8 AMPK活力對宰后牦牛肉LDH活性的影響

LDH是糖酵解和糖異生過程中的關鍵限速酶，在輔酶NAD+或NADH輔助下，實現乳酸和丙酮酸之間的可逆轉化，其活性的降低表明線粒體生理功能隨成熟時間的延長逐漸減弱[14]。由圖9可知，AICAR組、Compound C組和對照組中LDH活性隨著成熟時間的延長逐漸下降。相較于成熟6 h，168 h時三組LDH的活性顯著下降（P＜0.05），且AICAR組、Compound C組和對照組的LDH活性較成熟6 h時依次下降了36.87%、32.98%和33.67%。說明Compound C組LDH活性下降速率慢于AICAR組和對照組。從整體上來看，在同一成熟時間點，三者LDH活性依次為Compound C組＞對照組＞AICAR組。并且，除168 h外，在其余時間點，Compound C組的活性均顯著高于AICAR組（P＜0.05）。說明AMPK的激活會抑制LDH的活性。由于LDH可以促進NADH的生成，從而促使還原酶還原MMb，維持肉色的穩定性[24]。同時，Kim等[25]在研究乳酸含量與肉色穩定性的關系中，得出LDH活性與a*值具有較為顯著的正相關性（P＜0.05），與MMb相對含量為顯著的負相關性（P＜0.05）。因此，可以得出AMPK活性的抑制可以提高LDH的活性，從而能夠維持肉色穩定。

圖9 成熟期間牦牛肉LDH活性的變化Fig.9 Changes of LDH activity of yak beef during postmortem aging

2.9 AMPK活力對宰后牦牛肉己糖激酶活性的影響

己糖激酶在糖酵解過程中以限速酶的身份存在，因此宰后糖酵解的程度和速度受其活性的影響。由圖10可知，隨著成熟時間的延長，AICAR組、Compound C組和對照組中己糖激酶的活性均呈先上升后下降趨勢，與AMPK活性變化趨勢相同。在成熟初期（6～12 h），三者己糖激酶活性顯著上升（P＜0.05），且AICAR組的己糖激酶活性顯著高于其余兩組（P＜0.05），而Compound C組與對照組之間差異不顯著（P＞0.05）；12 h后，三者己糖激酶活性顯著下降（P＜0.05），且在24～120 h時間段內，對照組的己糖激酶活性顯著低于AICAR組（P＜0.05），顯著高于Compound C組（P＜0.05）。宰后牦牛成熟過程中，己糖激酶活性與其AMPK活性變化趨勢相一致，說明AMPK的活性可能影響己糖激酶的活性，從而促進糖酵解。Holmes等[26]連續5 d將AICAR注射入老鼠的體內，使AMPK慢慢活化，導致骨骼肌中己糖激酶活性顯著增加，進而加速糖酵解的進程，該研究結果證實了上述猜想。

圖10 成熟期間牦牛肉己糖激酶活性的變化Fig.10 Changes of hexokinase activity of yak beef during postmortem aging

2.10 AMPK活力對宰后牦牛肉肌酸激酶活性的影響

肌酸激酶與肌肉收縮、能量代謝和ATP合成等過程都具有一定的相關性，磷酸肌酸在肌酸激酶的催化下，能夠在動物宰后較短時間內對ATP的消耗起到緩沖作用[9]。由圖11可知，隨著成熟時間的延長，AICAR組、Compound C組和對照組中肌酸激酶的活性均呈先下降后上升趨勢，在成熟初期（6～12 h），三者肌酸激酶活性逐漸上升；12 h后，三者己糖激酶活性逐漸下降。與AMPK活性變化的趨勢剛好相反。在整個成熟過程中，Compound C組的肌酸激酶活性始終顯著高于AICAR組（P＜0.05）。這是由于AMPK與磷酸肌酸供能體系之間存在一定的相互作用，AMPK可以通過磷酸化作用實現對肌酸激酶活性的抑制[9]。AMPK和磷酸肌酸供能體系都對ATP濃度的維持具有一定的作用，因此二者之間可能存在動態平衡，在供能方面具有互補性。

圖11 成熟期間牦牛肉肌酸激酶活性的變化Fig.11 Changes of creatine kinase activity of yak beef during postmortem aging

2.11 AMPK活力對宰后牦牛肉GS活性的影響

由圖12可知，AICAR組和對照組的GS活性隨著成熟時間的延長呈先下降后上升趨勢，而Compound C組的GS活性則在成熟6～72 h呈無規律變化，72 h后呈上升趨勢。在整個成熟階段，三者的GS活性始終為Compound C組＞對照組＞AICAR組，且在成熟6～24 h，Compound C組和對照組的GS活性始終顯著高于AICAR組（P＜0.05）。由于在離體骨骼肌細胞中，激活AMPK可使己糖激酶和磷酸果糖激酶活化，促使GS失去活性，加快葡萄糖氧化以及糖酵解進程，與此同時糖異生和糖原合成受到抑制[7]。說明AMPK活性的激活，會抑制GS的活性，從而影響糖原含量進而影響糖酵解及肉色。

圖12 成熟期間牦牛肉GS活性的變化Fig.12 Changes of GS activity of yak beef during postmortem aging

2.12 AMPK活力對宰后牦牛肉NADH含量的影響

由圖13可知，AICAR組、Compound C組和對照組的NADH含量隨著成熟時間的延長而顯著下降趨勢（P＜0.05）。這是因為在肌肉組織中線粒體結構損傷引起的呼吸作用衰退導致NADH含量顯著降低[19]。成熟6 h時，AICAR組、Compound C組和對照組的NADH含量分別為342.87、555.24和456.19 ng/g，成熟168 h時，三者NADH含量依次下降至131.78、306.70和274.75 ng/g。在同一成熟時間點，對照組的NADH含量顯著低于Compound C組（P＜0.05），且顯著高于AICAR組（P＜0.05）。由于NADH是MetMbR還原MMb過程中必不可少的一種輔酶[19]。MetMbR活性受NADH濃度變化的影響，當健康畜禽屠宰后胴體中的NADH濃度上升，肌細胞線粒體中的MetMbR活性也相應的有所提高[26]。由此可知，Compound C組MetMbR活性優于其余兩組，該結果與圖6結果一致。進一步說明肌肉組織中Compound C抑制AMPK的活化，提高了NADH的含量，使得MetMbR活性有所提高，從而增強了肉色的穩定性。

圖13 成熟期間牦牛肉NADH含量的變化Fig.13 Changes in NADH content of yak beef during postmortem aging

2.13 能量代謝指標與肉色參數之間的相關系數

由表2可知，a*值與己糖激酶活性、乳酸脫氫酶活性、糖原含量和NADH含量呈極顯著的正相關（P＜0.01），與肌酸激酶活性和糖原合成酶活性呈極顯著的負相關（P＜0.01），與乳酸含量呈顯著的負相關（P＜0.05）。H*值與肌酸激酶活性、乳酸含量呈極顯著的正相關（P＜0.01），與GS活性呈顯著正相關（P＜0.05），與LDH活性、糖原含量和NADH含量呈極顯著的負相關性（P＜0.01）。由于a*值越高，H*值越低，表示肉色越鮮紅，說明隨著己糖激酶活性、乳酸脫氫酶活性的提高，糖原含量和NADH含量的增加，肌酸激酶活性和糖原合成酶活性及乳酸含量的下降均能在一定程度上使新鮮牦牛肉保持鮮紅色。結合前文可知，AMPK活性的抑制能夠提高乳酸脫氫酶活性、NADH含量和糖原含量，并且降低乳酸含量來維持肉色的穩定性。由此可以推斷，在牦牛背最長肌在成熟過程中，AMPK活性的抑制通過增加NADH的含量、糖原含量、乳酸脫氫酶活性及降低乳酸含量來維持肉色的穩定性。

表2 能量代謝指標與肉色參數相關系數Table 2 Correlation coefficients of energy metabolism index and color parameters

3 結論

Compound C能夠抑制牦牛宰后成熟過程中AMPK的活性，顯著抑制糖原的降解（P＜0.05），降低乳酸的積累速率，提高GS、肌酸激酶和LDH的活性，增加NADH含量，抑制己糖激酶活性，同時Compound C組的L*值、b*值、H*值以及MMb含量始終小于對照組，a*值、TMb、OMb含量和MetMbR活性高于對照組。由此可知，AMPK活性的抑制有利于牦牛背最長肌在成熟期間維持肉色的穩定。Compound C并不是肉品加工中普遍存在的試劑，要使牦牛肉肉色在宰后成熟期間維持良好的穩定性，還需要探究通過其他途徑對AMPK的活性進行抑制。而代謝壓力和導致細胞能量失衡的外源性化合物均可以改變AMPK的活性，比如在營養匱乏、劇烈運動或是熱休克條件下都可以將其激活。因此，未來可以對以上幾種情況做進一步的探究，從而更好的維持肉色的穩定性。