壁材對方竹葉黃酮微膠囊結構及抗氧化性能的影響

黃 珊，劉 嘉，李貴華，劉永翔,3，黃畢應，李 俊,

（1.貴州省農業科學院食品加工研究所，貴州貴陽 550006；2.貴州省福泉市牛場鎮人民政府，貴州黔南 550508；3.貴州省生物技術重點實驗室，貴州貴陽 550006）

方竹（Chimonobambusa quadrangularis（Fenzi）Makino）是我國特有的優質筍用竹種之一，具有極高的食用價值和經濟價值，廣泛分布于四川省與云貴交界的大婁山區域[1]。近年來貴州大力發展竹產業，省內方竹種植面積大約20萬 hm2，貴州桐梓于2014年被評為“中國方竹筍之鄉”，2015年“桐梓方竹筍”獲選為國家地理標志產品[2]。與竹子的根、莖等相比，竹葉的利用率很低，常被作為廢棄物。竹葉中含有黃酮類、生物多糖、蒽醌類、酚酸類等多種活性物質，具有良好的應用價值[3]，已在食品、醫療等領域廣受關注。竹葉提取物主要抗氧化成分包括黃酮、內酯和酚酸類化合物[4]，其中黃酮類化合物主要是黃酮糖苷，包括葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷等[5]，研究發現植物黃酮在胃腸道消化中易被降解，會導致生物可及性及穩定性降低，這限制了其生物活性的發揮[6-7]。因此，如何保證竹葉提取物的穩定性，對竹葉黃酮的應用具有極其重要的價值。

微膠囊技術起源于上世紀三十年代，它利用天然或合成高分子材料，把氣、液或固體芯材包埋起來形成一種半透性膜或密封的微小粒子[8]，其中噴霧干燥法是食品工業中最常用的微膠囊化工藝，具有生產成本低、工藝簡單、可包埋熱敏性的物質以及適于工業化生產等優點，在包埋食品中的生物活性物質及功能性脂質方面備受青睞[9]，孫亞利等[10]以熱誘導的聚合乳清蛋白為壁材制備的苦蕎黃酮微膠囊，品質較優，感官較佳，具有良好的貯藏穩定性和緩釋性。李楊等[11]以乳清分離蛋白、大豆分離蛋白和豌豆分離蛋白分別與麥芽糊精作為復合壁材，發現大豆分離蛋白制備的魚油微膠囊熱穩定性最高。Wang等[12]利用乳清分離蛋白和卵磷脂制備出的微膠囊表現出良好的包埋率和再分散性。

目前竹葉黃酮的相關研究主要集中在抗氧化活性等方面[13-14]，而對于竹葉黃酮微膠囊包埋壁材的選擇及其對產品的理化性質影響研究較少。本實驗采用超聲輔助乙醇提取方竹葉中的黃酮，探究麥芽糊精、阿拉伯膠、明膠、大豆分離蛋白、月桂酸單甘酯等不同類型壁材對竹葉黃酮微膠囊性能的影響；探究適合竹葉黃酮微膠囊包埋的壁材，制備具有良好抗氧化活性的竹葉黃酮微膠囊，為竹葉提取物功能產品的開發提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

方竹葉 由貴州省林業科學研究院提供，在60 ℃烘箱中烘干10 h，使含水量達到12.0%±0.5%，用粉碎機粉碎后過100目網篩，放于干燥器中備用；蘆丁標準品（≥98%） 北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl，DPPH）、硝酸鈉、無水乙醇、亞硝酸鋁、三氯化鐵、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、三氯醋酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；麥芽糊精、阿拉伯膠、明膠、大豆分離蛋白、月桂酸單甘酯 均為食品級，山東文興生物科技有限公司；所用水 為超純水。

HHS型數顯恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；UV-6000型紫外可見分光光度計上海元析儀器有限公司；G-040s型超聲波清洗機深圳市歌能清洗設備有限公司；Mastersizer2000激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；B-290噴霧干燥機 瑞士BüCHI公司；S-3400N掃描電子顯微鏡日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 方竹葉黃酮樣液的制備 采用超聲輔助醇提法，依據前期預實驗優化，稱取粉碎后的竹葉粉20.0 g，加入1000 mL 75%（v/v）乙醇，設定超聲功率為80 W，溫度55 ℃，時間60 min，提取方竹葉黃酮，經旋轉蒸發純化后，獲得方竹葉黃酮濃縮溶液備用。

1.2.2 方竹葉黃酮含量測定 參考李俊等[15]的方法測定樣品中的總黃酮含量（mg/mL）。以蘆丁標準溶液濃度為橫坐標x，吸光值為縱坐標y繪制標準曲線，得回歸方程為：y=1.754x-0.0051，R2=0.9991，經測定方竹葉黃酮濃縮溶液中黃酮含量為3.46 mg/mL。

1.2.3 方竹葉黃酮微膠囊的制備 準確稱取一定量的壁材（麥芽糊精、阿拉伯膠、明膠、大豆分離蛋白及月桂酸單甘酯）倒入50 ℃蒸餾水溶解配成懸浮液（w/v，5%）并均質15 min，然后加入方竹葉黃酮提取液，芯壁比為1:5，再次均質10 min后進行噴霧干燥[16]，即得到方竹葉黃酮微膠囊，以未經壁材包埋直接噴霧干燥得到的方竹葉黃酮微膠囊為對照組，噴霧干燥工藝參數為：進風溫度180 ℃，出風溫度115 ℃，進料速率15 mL/min。

1.2.4 微膠囊理化性質測定

1.2.4.1 微膠囊包埋率的測定 參考Lv等[17]的方法，并做適當的改動。總黃酮含量的測定：準確稱取20 mg干燥后的微膠囊，加入200 mL 75%（v/v）乙醇，超聲處理30 min，3500 r/min離心10 min，取上清液定容至25 mL，測定吸光度，根據標線計算微膠囊產品總黃酮含量。表面黃酮含量的測定：準確稱取20 mg干燥后的微膠囊，加入200 mL無水乙醇，充分震蕩后過濾定容至25 mL，吸取一定量溶液測定吸光度，根據標線計算微膠囊產品表面黃酮含量。微膠囊的包埋率按公式（1）計算：

式中：R代表包埋率，%；Ct代表總黃酮含量，mg/mL；Cs代表表面黃酮含量，mg/mL。

1.2.4.2 休止角測定 準確稱取5 g微膠囊樣品倒入漏斗，使微膠囊通過漏斗自然下落，在水平圓板上堆積。每一樣品進行3次平行試驗[18]。測量粉堆高度H及粉堆覆蓋半徑R，休止角θ按公式（2）計算：

1.2.4.3 堆積密度測定 準確稱取3 g竹葉黃酮微膠囊樣品倒入帶有刻度的量筒中，反復振動使微膠囊粉末自然下沉，直至樣品不能被壓縮，計算單位體積微膠囊的質量，重復3次。

1.2.4.4 水分含量測定 參照GB/T 5009.9-2016《食品中水分含量測定》。

1.2.5 微觀結構 取適量的未包埋和不同包埋壁材的微膠囊于導電膠上，于真空鍍膜機中噴金后固定在樣品臺上，然后放入顯微鏡腔室中對微膠囊進行掃描，觀察微膠囊固體表觀形貌[19]。

1.2.6 粒徑分布測定 以超純水為分散劑，稱取適量竹葉黃酮微膠囊溶解于分散劑中，通過激光粒度儀來測定粉體的粒度分布[20]。

1.2.7 抗氧化活性測定

1.2.7.1 DPPH自由基清除活性 配制79 mg/L的DPPH-乙醇溶液，低溫避光保存備用。分別取未包埋和不同包埋壁材的黃酮微膠囊溶于乙醇中，黃酮質量濃度依次為200、400、600、800、1000 μg/mL。分別取0.5 mL不同質量濃度的未包埋和不同包埋壁材的黃酮微膠囊樣液，加入5.0 mL的DPPH-乙醇溶液混合均勻，37 ℃反應1 h，以相應乙醇為空白，在波長為517 nm處比色，按式（3）計算DPPH自由基清除率[21]：

式中：A空白代表對照組吸光值；A樣品代表實驗組吸光值。

1.2.7.2 還原力測定 分別取未包埋和不同包埋壁材的黃酮微膠囊溶于乙醇中，使兩者的黃酮質量濃度均為200、400、600、800、1000 μg/mL。取2.5 mL的磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH6.6）和2.5 mL鐵氰化鉀（w/v，1%）混勻，分別移取1 mL上述不同質量濃度的樣液，加入反應體系內，搖勻后置于50 ℃水浴中20 min。流水快速冷卻，然后分別加入2.5 mL三氯醋酸（w/v，10%）終止反應，3000 r/min離心10 min，離心后取2.5 mL上清液，加入到2.5 mL蒸餾水和0.5 mL三氯化鐵（w/v，0.1%），搖勻后靜置10 min，在波長700 nm處測定樣品溶液吸光值[22]。

1.3 數據處理

采用Origin8.0軟件作圖，SPSS20.0數據統計軟件對試驗結果進行統計學分析，數據重復測定3次，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 方竹葉黃酮微膠囊的理化性質分析

微膠囊的包埋率、堆積密度、水分含量及休止角等會影響微膠囊產品的最終質量及其在銷售和存儲過程中的特性[23]。不同壁材方竹葉黃酮微膠囊的包埋率、堆積密度、水分含量及休止角結果如表1所示。包埋率是判斷微膠囊質量的重要指標，包埋率越高，對黃酮的保護作用較好，不同壁材的微膠囊之間包埋率不同且有一定顯著性差異（P＜0.05），阿拉伯膠的包埋率最高，為91.23%，且與麥芽糊精（90.10%）和明膠（89.73%）之間差異不顯著（P＞0.05），最低為月桂酸單甘酯。相比對照組，不同壁材微膠囊的堆積密度均有所提高，且一些不同壁材之間有顯著性差異（P＜0.05），月桂酸單甘酯與阿拉伯膠、麥芽糊精明膠、明膠與大豆分離蛋白之間有顯著差異（P＜0.05），其余壁材間沒有顯著性差異（P＞0.05），阿拉伯膠的堆積密度最大為0.53±0.01 g·cm-3，堆積密度越大表明其可儲存于更小的容器中，從而可以減少粉末空隙中的空氣量，有利于防止微膠囊氧化[24]，由此可知，包埋技術可以顯著提升微膠囊的堆積密度，減輕微膠囊的氧化，有利于穩定微膠囊的品質及保存。

表1 不同壁材制備的方竹葉黃酮微膠囊理化性質比較Table 1 Comparison of physiochemical properties of the bamboo leaves flavonoids microcapsules prepared with different wall materials

不同壁材微膠囊的水分含量都顯著低于對照組（P＜0.05），說明經過壁材包埋后有效降低了微膠囊中的水分含量，而較低的水分含量有利于微膠囊的儲存。其中阿拉伯膠最低，為5.33%，其與大豆分離蛋白、麥芽糊精和明膠之間沒有顯著性差異（P＞0.05），在這四者中，麥芽糊精的水分含量偏高，可能是因為麥芽糊精是公認的非常吸濕的材料，易吸收水分。在Goula等[25]的研究中也將橙汁微膠囊的高含水量歸因于高濃度的麥芽糊精。微膠囊之間呈現的水分含量差異是由于材料對水的親和力不同，以及水分通過壁材基質的擴散系數不同導致的[26]。

休止角是衡量粉末產品流動性的重要指標，一般來說，當休止角≤30°時粉末的流動性很好；休止角為30°～45°產品流動性良好；休止角45°～60°產品流動性流動性一般；而休止角≥60°則流動性差[27]。實驗中，除對照組外，不同壁材的微膠囊的休止角均小45°，其中阿拉伯膠的休止角最低，說明以不同壁材制備的微膠囊粉末的流動性較好，經壁材包埋能有效的改善微膠囊粉末的流動性能，這與劉成祥[18]在研究牡丹籽油微膠囊流動性質中發現相似。綜合比較以阿拉伯膠為壁材的微膠囊性能更優，能滿足生產要求。

2.2 方竹葉黃酮微膠囊的微觀結構分析

不同包埋壁材的微膠囊的微觀結構如圖1所示。從圖1中可以看出不同包埋壁材處理下的微膠囊表面結構及大小存在差異，但同一包埋壁材的微膠囊顆粒大小也存在一定差異，這可能與液滴從高壓噴槍中噴出時形成的液滴大小有直接關系[28]。圖1a中微膠囊外部結構未呈現球形顆粒且出現大塊粘連的情況，這與膠囊未進行壁材包埋處理有直接關系。圖1b和圖1f中微膠囊未呈現球型顆粒且表面有凹陷，可能是在干燥過程中，液滴之間出現相互碰撞、相互擠壓造成，也有研究表明微膠囊表面出現的典型褶皺或凹陷現象與壁材中碳水化物的含量有關[29]，特別是在冷卻階段，如果微膠囊壁材的固化要先于熱氣流造成的膨脹，使壁材收縮而產生凹陷或褶皺[30]，圖1b中微膠囊表面還有孔洞，這是由于在高噴霧干燥速率下，干燥顆粒內部空氣或蒸汽的熱膨脹可以平整凹痕，但也可能使囊膜破裂，導致孔洞的形成[31]。

圖1 c、圖1d和圖1e大部分微膠囊呈球形顆粒，表面光滑平整，凹陷較少且大小均一，這很可能是因為這些碳水化合物組成的壁材體系具有更高的分子柔性，表現出更多的分子構型，導致成膜均勻[32]，微膠囊致密性較好。與對照組相比，經過壁材包埋處理的微膠囊在結構形態上更加穩定，這對于芯材的保護和避免氧化，提高微膠囊穩定性至關重要。綜上所述，阿拉伯膠、麥芽糊精及明膠制備的方竹葉黃酮微膠囊呈球形顆粒，表面光滑平整，凹陷較少且大小均一，在表觀更加出色。

圖1 不同壁材制備的方竹葉黃酮微膠囊的表面形態Fig.1 Outer morphology of the bamboo leaves flavonoids microcapsules prepared with different wall materials

2.3 方竹葉黃酮微膠囊的粒徑分析

粒徑是評價微膠囊體系質量的一個重要參數，粒徑小的微膠囊更有易于被人體吸收[33]。不同包埋壁材處理下的微膠囊平均粒徑和粒度分布圖見圖2。由圖2可知，阿拉伯膠包埋體系粒徑分布呈現正態分布，其制備的竹葉黃酮微膠囊的粒徑分布均勻且集中，而對照組微膠囊粒徑呈現雙峰分布，雙峰跨度較小，麥芽糊精、明膠、月桂酸單甘酯及大豆分離蛋白包埋體系呈現雙峰分布且雙峰跨度較大，粒徑分布不集中。粒徑分布曲線中具有單峰分布以及峰較窄或峰下面積較小的包埋體系，表示微膠囊粒徑均勻且穩定[34]，可知阿拉伯膠顯示出良好的包埋能力以形成細小的微膠囊。

圖2 不同壁材對方竹葉黃酮微膠囊平均粒徑和粒度分布的影響Fig.2 Effects of different wall materials on mean particle size and particle size distribution of the bamboo leaves flavonoids microcapsules

微膠囊平均粒徑大小依次為月桂酸單甘酯（22.87 μm）＞大豆分離蛋白（15.65 μm）＞麥芽糊精（14.26 μm）＞明膠（8.95 μm）＞阿拉伯膠（6.96 μm）＞對照組（3.80 μm），由此可知經過包埋后微膠囊的粒徑顯著提升，不同處理下微膠囊的粒徑產生較大差異，其可能是由于制備過程中水分瞬間蒸發的速率不同導致顆粒產生不同的收縮力度，從而得到不同粒徑的微膠囊[35]；在同等實驗條件下，阿拉伯膠制備的微膠囊平均粒徑低且包埋體系粒徑分布呈現正態分布，是理想的包埋壁材。

2.4 方竹葉黃酮微膠囊抗氧化活性及還原性分析

2.4.1 方竹葉黃酮微膠囊抗氧化活性分析 如圖3所示，未經包埋的對照組以及不同包埋壁材處理下的微膠囊清除DPPH自由基能力都展現出與劑量成正相關，隨著質量分數濃度的增加抗氧化能力不斷增強。麥芽糊精包埋處理下的微膠囊清除DPPH自由基的能力最高，經計算如表2所示，其清除DPPH自由基的IC50為258.67 μg/mL，對照組IC50為681.83 μg/mL，月桂酸單甘酯IC50為532.80 μg/mL，阿拉伯膠IC50為364.30 μg/mL，明膠IC50為446.53 μg/mL，大豆分離蛋白IC50為518.83 μg/mL，IC50值越小證明微膠囊抗氧化性能力越強，則微膠囊清除DPPH自由基的能力依次為麥芽糊精＞阿拉伯膠＞明膠＞大豆分離蛋白＞月桂酸單甘酯＞對照組，經過包埋處理的微膠囊清除DPPH自由基能力明顯高于未經包埋的對照組，可能是因為經包埋的微膠囊，黃酮抗氧化物質進入包埋空腔內，使客體分子穩定性增加，更易與DPPH中的自由基反應[36]。而不同包埋壁材處理下的微膠囊清除DPPH自由基能力也有所差異，可能是由于不同壁材的本身特性所決定的；還有可能是因為不同壁材包埋形成的微膠囊顆粒的表面積不同，而與反應溶液接觸不同所致[21,37]。

圖3 不同壁材制備的方竹葉黃酮微膠囊DPPH自由基清除能力對比Fig.3 Comparison of DPPH free radical scavenging activities of the bamboo leaves flavonoids microcapsules prepared with different wall materials

表2 不同壁材制備的方竹葉黃酮微膠囊的抗氧化活性（IC50）Table 2 Antioxidant activity(IC50) of the bamboo leaves flavonoids microcapsules prepared with different wall materials

2.4.2 方竹葉黃酮微膠囊還原能力分析 由圖4可知，不同包埋壁材微膠囊鐵還原力也同樣隨著質量濃度的增加而增強，呈現出明顯的劑量正效應關系，且經過包埋處理的微膠囊鐵還原力明顯高于未經包埋的對照組，質量濃度為200 μg/mL時，微膠囊鐵還原力依次為阿拉伯膠（0.496）＞麥芽糊精（0.457）＞大豆分離蛋白（0.411）＞月桂酸單甘酯（0.375）＞明膠（0.365）＞對照組（0.264）；質量濃度為800 μg/mL時，微膠囊鐵還原力依次為麥芽糊精（0.936）＞阿拉伯膠（0.918）＞明膠（0.907）＞大豆分離蛋白（0.829）＞月桂酸單甘酯（0.738）＞對照組（0.603），麥芽糊精及阿拉伯膠包埋竹葉黃酮微膠囊Fe3+還原力能力穩定。

圖4 方竹葉黃酮微膠囊還原能力對比Fig.4 Comparison of iron reduction capacity of the bamboo leaves flavonoids microcapsules

綜上可知，麥芽糊精及阿拉伯膠制備的微膠囊產品DPPH自由基清除能力和Fe3+還原力強，都有較好的抗氧化活性及還原性。體外抗氧化實驗結果表明，在噴霧干燥法中利用不同包埋壁材制備的竹葉黃酮微膠囊性能穩定性均優于未包埋處理組，證明包埋可以有效提高微膠囊體外抗氧化活性，提高了竹葉黃酮微膠囊產品的貯存穩定性。

3 結論

本實驗通過對比分析5種不同壁材制備的方竹葉黃酮微膠囊產品包埋效果及性能的差異，結果發現，與對照組相比，經過壁材包埋處理的微膠囊在結構形態上更加穩定，物理性質得到改善，有效提高微膠囊體外抗氧化活性和還原能力，以及產品的貯存穩定性。以阿拉伯膠為壁材的微膠囊產品包埋效果好，其包埋率、堆積密度、休止角、含水量分別為91.23%±1.00%、0.53±0.01 g/cm3、33.27°±1.20°、5.33%±0.28%，并具有良好的流動性及儲存性能，平均粒徑最小，為6.96 μm，掃描電鏡結果顯示微膠囊呈球形且表面較為完整光滑，凹陷較少且大小均一，無不良感官性狀，在體外抗氧化活性及還原性實驗中，阿拉伯膠制備的微膠囊抗氧化活性及還原性較高。在此芯壁比條件下，阿拉伯膠可以作為制備方竹葉黃酮微膠囊的較佳壁材。