農桿?菌介導葡萄灰葡萄孢遺傳轉化條件優化

李廷剛，鞏東營

（1.山東省葡萄研究院，山東 濟南 250100；2.山東省農業科學院農產品加工與營養研究所，山東 濟南 250100）

灰霉病是葡萄生長及貯存期的重要病害，在我國主要由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染所致［1］。灰葡萄孢在自然界中可侵染200多種植物，包括番茄、絲瓜、草莓、葡萄等［2］，多以菌核在植株或者病殘體上越冬，翌年通過分生孢子傳播［3］。灰葡萄孢在葡萄生長過程中可侵染植株嫩莖、葉片、花穗、果實等大部分地上組織，發生嚴重時，可造成減產60%以上；在葡萄貯藏期是第一大病原菌，一旦發生可造成葡萄果粒腐爛，影響貯藏品質，造成嚴重損失［4］。灰葡萄孢寄主范圍廣、變異速度快、抵御不良環境能力強，因此防治極為困難。尋找灰葡萄孢致病基因、探索致病機制，可為灰霉病綜合防控奠定基礎。

遺傳轉化是研究病原菌致病基因功能的重要技術基礎，農桿菌介導的遺傳轉化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）是目前應用較為廣泛的轉化技術［5］。農桿菌可以侵染真菌細胞，利用所攜帶的Ti質粒，將T-DNA區隨機整合到受體細胞的基因組中，轉化過程受到多種小分子多糖及酚類物質等的雙重調節，其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）在該過程中起促進作用［6］。ATMT技術因其轉化受體要求低、操作流程簡單、轉化效率高、轉化子穩定性強、轉化子單拷貝插入等優勢，目前已在水稻稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、橡膠樹炭疽病菌（Colletotrichum musae）等多種病原真菌中得到廣泛應用［7-10］。

目前，在灰葡萄孢遺傳轉化研究中，ATMT技術也得到了較好的應用。陶嵐［11］利用ATMT技術構建了草莓灰葡萄孢突變體庫，并從中篩選出463個致病力異常的轉化子。王璇等［12］通過篩選基于ATMT技術構建的番茄灰葡萄孢突變體庫，得到分生孢子產生缺陷轉化子BCt78。范雷等［13］通過優化月季灰葡萄孢RoseBc-3的ATMT體系，篩選獲得6類不同表型轉化子。沈衛鋒等［14］利用ATMT技術成功獲得了綠色熒光蛋白重組灰葡萄孢。Zhang等［15］通過篩選番茄灰葡萄孢ATMT突變體庫，得到分生孢子產生缺陷轉化子BCG183，定位確定候選基因BcKMO，進一步證明該基因可參與調控細胞壁降解酶活性、毒素活性和細胞壁完整性等。不同寄主灰葡萄孢具有其自身特異性，目前鮮有關于葡萄灰葡萄孢ATMT的相關研究。本試驗以分離自葡萄的灰葡萄孢BcSD3菌株為材料，研究建立并優化其ATMT體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

葡萄灰葡萄孢BcSD3菌株（高毒力菌株），于2020年7月分離自山東煙臺‘巨峰’葡萄灰霉病花穗。根癌農桿菌EHA105菌株、質粒pBIG3C（含潮霉素抗性基因）均由本實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 灰葡萄孢分生孢子制備 將灰葡萄孢BcSD3菌株接種于PDA培養基上，參照李廷剛等［16］報道的方法進行誘導產孢；使用滅菌水洗脫分生孢子，并用三層滅菌濾紙過濾去除菌絲等雜質；離心收集分生孢子，并調節至適宜濃度，保存備用。

1.2.2 根癌農桿菌菌液制備 采用熱擊法將pBIG3C質粒轉入根癌農桿菌EHA105菌株中；篩選陽性菌斑接種于LB液體培養基（含50μg/mL卡那霉素）中，于28℃條件下搖培2 d；離心收集菌體，用誘導培養基將菌液稀釋至OD600值等于0.15，繼續培養直至OD600值達到0.8。

1.2.3 灰葡萄孢對潮霉素B敏感性測定 制備分別含有5、10、25、50、100μg/mL潮霉素B的PDA平板，以不添加潮霉素B的PDA平板作為對照，用打孔器打取灰葡萄孢菌餅接種在PDA平板中心位置；于23℃光暗交替條件下培養3 d，觀察菌落生長情況，每個處理6個平板，設置3次重復。

1.2.4 農桿菌對頭孢噻肟鈉敏感性測定 制備分別含有50、100、200、300、400μg/mL頭孢噻肟鈉的PDA平板，以不添加頭孢噻肟鈉的PDA平板作為對照，取已制備的OD600值為0.15的農桿菌菌液均勻涂布于平板上；于28℃黑暗條件下培養3 d，觀察菌落生長情況，每個處理6個平板，設置3次重復。

1.2.5 遺傳轉化條件優化 在含有不同濃度乙酰丁香酮（AS）的共培養培養基平板上平鋪一張玻璃紙，取100μL農桿菌與灰葡萄孢分生孢子混合液均勻涂布于玻璃紙上，在不同溫度條件下共培養不同時間，后將玻璃紙轉移至新的滅菌培養皿內，覆蓋PDA培養基（內含50μg/mL的潮霉素B和300μg/mL的頭孢噻肟鈉），在適宜溫度條件下光暗交替培養5 d，查看轉化子生長情況。其中所用灰葡萄孢分生孢子濃度分別為1×102、1×103、1×104、1×105、1×106個/mL；所用AS濃度分別為100、200、300、400μmol/mL，以不添加AS培養基平板作為對照；共培養溫度分別為15、20、25、30、35℃；共培養時間分別為24、48、72、96、120 h。

1.2.6 轉化子檢測與鑒定 隨機選取8個轉化子接種于不含抗生素的PDA平板上，待菌落生長至平板3/4面積時，打取菌餅轉接至新的不含抗生素的PDA平板上，連續轉接3代。之后打取菌餅，接種至含有50μg/mL潮霉素B的PDA平板上，觀察菌落生長情況，重復3次。使用CTAB法提取野生型灰葡萄孢和8個轉化子的基因組DNA，分別擴增潮霉素磷酸轉移酶（hph）基因的特異片段。對野生型灰葡萄孢和8個轉化子的基因組DNA進行HindⅢ單酶切，酶切完成后進行瓊脂糖凝膠電泳分析；以hph基因的特異擴增片段為模板，探針標記與檢測方法具體試驗步驟參照地高辛標記檢測試劑盒（羅氏）說明書進行。

1.3 數據處理與分析

使用Microsoft Excel 2010及SPSS 19.0進行數據統計及分析。

2 結果與分析

2.1 灰葡萄孢對潮霉素B敏感性測定

不同濃度潮霉素B對灰葡萄孢抑制作用測定結果如圖1所示，接種灰葡萄孢3 d后，與對照相比，5、10、25μg/mL潮霉素B可對灰葡萄孢菌絲生長產生不同程度的抑制作用，但仍可以生長；當潮霉素B濃度達到50μg/mL時，則可以完全抑制灰葡萄孢菌絲的生長。因此，本試驗選擇50 μg/mL潮霉素B作為轉化子的篩選濃度。

圖1 灰霉病菌在含有不同濃度潮霉素B的PDA培養基上生長情況

2.2 根癌農桿菌對頭孢噻肟鈉敏感性測定

不同濃度頭孢噻肟鈉對農桿菌抑制作用如圖2所示，農桿菌涂布后培養3 d，對照組農桿菌遍布整個平板，隨著頭胞噻肟鈉濃度的不斷提高，存活農桿菌菌落數不斷減少，抑制效果不斷增強；當濃度增至300μg/mL時，可完全抑制其生長。因此，本試驗選擇300μg/mL頭孢噻肟鈉作為轉化子的篩選濃度。

圖2 農桿菌在含有不同濃度頭孢噻肟鈉的PDA平板上生長情況

2.3 分生孢子濃度對轉化效率的影響

由圖3可知，隨分生孢子濃度的增加，每培養皿得到的轉化子數量不斷增加。分生孢子濃度為1×102、1×103、1×104、1×105、1×106個/mL每培養皿分別平均得到3、9、14、31個和67個轉化子。基于試驗操作和轉化子特異性綜合考慮，分生孢子濃度1×105個/mL為最適轉化濃度。

圖3 不同分生孢子濃度對轉化效率的影響

2.4 乙酰丁香酮濃度對轉化效率的影響

當不添加AS時，每個培養皿平均僅得到2個轉化子；隨著AS濃度不斷提高，轉化子數量不斷增加，濃度為200μmol/mL時每個培養皿平均可得到33個轉化子；之后，隨著AS濃度不斷增加轉化子數量不斷減少（圖4）。因此，AS濃度200μmol/mL為最佳轉化濃度。

圖4 不同乙酰丁香酮濃度對農桿菌轉化效率的影響

2.5 共培養溫度對轉化效率的影響

當共培養溫度為15℃時，每培養皿平均可得到7個轉化子；隨著共培養溫度不斷升高轉化子數量呈先增加后減少的趨勢，25℃時轉化效率最高，每培養皿平均可得到32個轉化子，當共培養溫度達到35℃時，每培養皿平均轉化子數量下降到11個（圖5）。因此，25℃為最佳共培養溫度。

圖5 共培養溫度對轉化效率的影響

2.6 共培養時間對轉化效率的影響

當共培養時間為24、48、72、96、120 h時，每皿分別平均可得到18、33、34、26個和22個轉化子；其中，共培養時間為48 h和72 h時轉化效率相當，且無顯著差異（圖6）。共培養時間越長轉化子有多拷貝插入的比例越高，因此，48 h為最適共培養時間。

圖6 共培養時間對轉化效率的影響

2.7 轉化子穩定性檢測及分子鑒定

隨機選取8個轉化子進行遺傳穩定性檢測，結果顯示，在含有50μg/mL潮霉素B的PDA培養基平板上所有轉化子均可正常生長。潮霉素磷酸轉移酶基因特異片段擴增結果如圖7a所示，灰葡萄孢野生型中無條帶，8個轉化子中均可擴增到特異性條帶，且大小與對照相同。表明，TDNA片段已經整合到灰葡萄孢基因組中，并且可以穩定遺傳。

轉化子Southern blot檢測結果如圖7b所示，灰葡萄孢野生型中無任何條帶，8個轉化子均可得到特異性條帶，其中6個轉化子為單拷貝插入，2個轉化子為雙拷貝插入，單拷貝插入比例可達到75%。表明hph基因已經整合到灰葡萄孢基因組中，且多以單拷貝形式插入。

圖7 轉化子PCR檢測及Southern blot分析

3 討論與結論

遺傳轉化是研究真菌基因功能的重要技術手段，常用的遺傳轉化技術包括PEG介導的原生質體遺傳轉化、限制酶介導的原生質體遺傳轉化等［17-19］。ATMT技術因其無需制備原生質體、單拷貝插入率高、操作流程簡單、轉化效率高等優點，在多種真菌遺傳轉化研究中得到了較好的應用［20，21］。但不同真菌間、甚至同一真菌不同種間的遺傳轉化條件存在較大差異，主要受共培養培養基中AS濃度、共培養液中分生孢子濃度、共培養溫度以及共培養時間等因素影響。本研究建立了葡萄灰葡萄孢ATMT體系，為開展其基因功能研究奠定了技術基礎。

分生孢子濃度與轉化效率大致呈正相關趨勢，這主要是因為分生孢子濃度的提高增加了農桿菌侵染的概率，從而提高了轉化效率。由于一個培養皿中轉化子過多會造成菌落相互覆蓋，不利于后期轉化子的分離純化，因此分生孢子應選擇適宜濃度。AS對Ti質粒上vir基因的活化起重要作用，因此在共培養培養基中需加入適當濃度的AS以提高轉化效率。本研究中AS最佳濃度為200μmol/mL，之后隨著濃度繼續提高，轉化效率逐漸下降。推測這可能是因為過高濃度的AS對轉化子產生了毒害作用，抑或是抑制了Ti質粒上的vir基因的表達，從而導致轉化效率下降。

共培養溫度對轉化效率的影響呈正態分布趨勢，最佳共培養溫度為25℃，過低或者過高均會導致轉化效率下降。推測這可能是因為灰葡萄孢分生孢子具有自己最適的生長溫度；同時，Ti質粒上vir基因的表達也較易受到溫度的影響。本研究中最適共培養時間為48 h，共培養時間過短會導致農桿菌未能完成侵染，從而造成轉化效率不高；共培養時間過長，也會導致轉化效率下降。這或許是因為共培養時間過長導致轉化子生活力衰弱，從而影響轉化效率。此外，共培養時間過長還易導致轉化子中多拷貝插入的現象，為后續開展基因功能研究帶來不便［22］。